Name: acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

O autor gostaria de agradecer a Steve Siegelbaum pelo apoio. O financiamento é fornecido pelo 5R01NS106983-02, bem como 1 F31 NS113466-01.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia (AC-AAAU9451).
1. Preparar soluções
<ol><li>Prepare a solução de corte de sacarose para fatiamento, conforme descrito na Tabela 1. NOTA: Após preparar 1 L de solução de sacarose, congele uma pequena quantidade (aproximadamente 100-200 mL) em uma bandeja de gelo. Estes cubos de gelo de sacarose congelados serão mistur...

Existem várias etapas neste protocolo de corte projetado para promover a saúde do tecido e favorecer o surgimento da atividade de rede naturalista espontânea: o camundongo é transcardialmente perfumado com solução de corte de sacarose resfriada; as fatias do córtex horizontal-entorhinal (HEC) são cortadas a uma espessura de 450 μm do hipocampo intermediário ou ventral; as fatias se recuperam na interface do ACSF aquecido e do ar umidificado e rico em carbogen; durante as gravações as fatias são superfundidas...

A medição eletrofisiológica de fatias hipocampais vivas in vitro é uma abordagem experimental poderosa com inúmeras vantagens. O experimentador pode usar um microscópio, micromanipuladores e um sistema de gravação para visualizar e coletar diretamente medições de neurônios individuais no tecido. As fatias de tecido também são muito acessíveis à fotostimulação ou à entrega de medicamentos para experimentos optogenéticos, quimigênicos ou farmacológicos.
A rede hipocampal gera atividade populacional altamente síncrona in vivo,visível como oscilações no potencial de campo local extracelular1,2,3,4,5. Os métodos de fatia cerebral foram aproveitados para obter uma visão dos mecanismos celulares e de circuito subjacentes a essas oscilações da rede neuronal. O trabalho fundamental de Maier et al. demonstrou que complexos de ondas acentuadas (SWRs) podem surgir espontaneamente em fatias do hipocampo ventral6,7. Estudos subsequentes de múltiplos pesquisadores têm gradualmente elucidado muitos aspectos das SWRs, incluindo o papel dos neuromoduladores na regulação do estado de rede do hipocampo8,9,10 e os mecanismos sinápticos que impulsionam a reativação in vitro de conjuntos neuronais anteriormente ativos durante o comportamento in vivo11. Experimentos com fatias cerebrais também forneceram uma visão da oscilação da gama gama gama (30-100 Hz), um estado distinto da rede hipocampal que se acredita apoiar a codificação da memória e recordar12,13. Finalmente, reconhecendo o papel central do hipocampo e das estruturas associadas na fisiopatologia da epilepsia do lobo temporal14,15, pesquisadores têm usado preparações de fatias hipocampais para investigar a geração e propagação da atividade epilépforme. Carter et al. demonstraram que fatias combinadas de córtex hipocampal-entorhinal preparadas a partir de animais cronicamente epilépticos podem gerar espontaneamente descargas epilépticas in vitro16. Posteriormente, Karlócai et al. exploraram os mecanismos subjacentes às descargas epilépformas em fatias hipocampais usando fluido cerebrospinal artificial modificado (ACSF) com concentrações de íons alteradas (Mg2+ ou K+elevados ) ou drogas adicionadas (4AP ou gabazina)17.
Os pesquisadores desenvolveram numerosas abordagens de fatias hipocampais que diferem de formas-chave: (1) a região do hipocampo contida na fatia (dorsal, intermediária ou ventral); (2) a presença ou ausência de tecidos extrahiptocampais, como o córtex entorhinal; (3) a orientação utilizada para cortar fatias (coronal, sagital, horizontal ou oblíqua); e (4) as condições sob as quais o tecido é mantido após o corte (submerso totalmente em ACSF ou mantido na interface do ACSF e ar umidificado, rico em carbogênio).
A escolha de qual abordagem de corte deve ser determinada pelo objetivo experimental. Por exemplo, fatias transversais ou coronais do hipocampo dorsal mantidas em condições submersas têm sido utilizadas de forma muito eficaz para a investigação de circuitos intrahipotecampal e plasticidade sináptica18,19,20. No entanto, tais preparações não geram espontaneamente oscilações de rede tão facilmente quanto fatias do hipocampo ventral21,22,23. Embora um estado de atividade SWR persistente possa ser induzido pela estimulação tetanica em fatias transversais do hipocampo dorsal e ventral24, swRs espontâneos são mais facilmente observados em fatias ventrais7,25.
Uma distinção fisiológica e anatômica inerente entre o hipocampo dorsal e ventral é apoiada por estudos realizados tanto in vivo quanto in vitro26. Gravações em ratos revelaram ritmos de fortemente coerentes em todo o hipocampo dorsal e intermediário, mas com pouca coerência entre a região ventral e o resto do hipocampo27. SWRs in vivo propagam-se prontamente entre o hipocampo dorsal e intermediário, enquanto os SWRs que se originam no hipocampo ventral permanecem frequentemente locais28. As projeções associacionais originárias de neurônios piramimais ca3 que residem no projeto de hipocampo dorsal e intermediário a longas distâncias ao longo do eixo longitudinal do hipocampo. As projeções de CA3 originárias de regiões ventrais permanecem relativamente locais e, portanto, são menos propensas a serem cortadas durante o processo de corte29,30. As fatias ventrais podem, portanto, preservar melhor a rede recorrente necessária para gerar sincronia populacional. A propensão de fatias ventrais para gerar atividades espontâneas de rede in vitro também pode refletir maior excitabilidade intrínseca de neurônios piramidários ou inibição mais fraca do hipocampo ventral em comparação com regiões mais dorsais31. De fato, as fatias hipocampais ventrais são mais suscetíveis à atividade epilépforme32,33. Assim, muitos estudos de fisiológicas espontâneas8,9,11,24 ou patológicos16,34,35,36 oscilações de rede têm tradicionalmente utilizado uma abordagem de corte horizontal, às vezes com um leve ângulo na direção fronto-occipital, que produz fatias de tecido paralelas ao plano transversal do hipocampo ventral.
A conectividade de rede é inevitavelmente impactada pelo procedimento de corte, pois muitas células na fatia serão cortadas. O ângulo e a espessura da fatia e o tecido retido na preparação devem ser considerados para otimizar a conectividade nos circuitos de interesse. Muitos estudos utilizaram fatias horizontais combinadas de córtex hipocampal-entorhinal (HEC) para explorar interações entre as duas estruturas no contexto de oscilações fisiológicas ou patológicas da rede. Roth et al. realizaram gravações duplas do subcampo CA1 do hipocampo e da camada V do córtex entorhinal medial para demonstrar a propagação da atividade SWR através da fatia HEC37. Muitos estudos de atividade epilepiforme têm utilizado a preparação da fatia hec para investigar como as descargas epilépformes se propagam através da rede corticohippocampal16,35,36,38. É importante notar que a preservação do laço corticohippocampal intacto não é um pré-requisito para SWRs espontâneos, descargas epilépticas ou oscilações gama; oscilações de rede podem ser geradas em fatias transversais do hipocampo dorsal ou ventral sem tecidos parahiptocampais anexados21,22,23, 25,39,40,41. Um fator mais importante para a geração espontânea de oscilações de rede em fatias hipocampais pode ser a espessura de cada fatia, pois uma fatia mais grossa (400-550 μm) preservará mais conectividade na rede recorrente CA2/CA321,22,25.
Embora as fatias de HEC horizontais angulares (cortadas com ângulo de aproximadamente 12° na direção fronto-occipital) tenham sido utilizadas para estudar a conectividade funcional do laço corticohippocampal11,16,34,35,42, tais preparações angulares não são necessárias para a atividade espontânea da rede43,44,45. No entanto, o uso de um plano de corte angular permite ao investigador fazer seletivamente fatias que melhor preservem o lamellae transversalmente orientado do hipocampo ventral ou intermediário, dependendo se um ângulo para baixo ou para cima é aplicado(Figura 1). Esta abordagem é conceitualmente semelhante à usada por Papatheodoropoulos et al., 2002, que dissecou cada hipocampo livre e depois usou um helicóptero de tecido para criar fatias transversais ao longo de todo o eixo dorsal-ventral21. À luz das distinções funcionais acima mencionadas entre o hipocampo ventral e dorsal-intermediário, os pesquisadores devem considerar a origem anatômica das fatias ao projetar experimentos ou interpretar resultados. O uso de uma rampa de ágar durante o procedimento de corte é uma maneira simples de produzir preferencialmente fatias do hipocampo intermediário ou ventral.
As fatias hipocampais podem ser mantidas em uma câmara submersa (com o tecido totalmente imerso em ACSF), ou em uma câmara de estilo interface (por exemplo, câmara de Oslo ou Haas, com fatias cobertas apenas por uma fina película de mídia fluindo). A manutenção da interface aumenta a oxigenação do tecido, o que promove a sobrevivência neuronal e permite altos níveis sustentados de atividade interneuronal. Tradicionalmente, as condições de gravação submersas utilizam uma taxa de fluxo ACSF mais lenta que não fornece oxigenação adequada do tecido para uma expressão estável de oscilações em nível de rede. Em fatias hipocampais submersas, as oscilações gama induzidas por carbachol são observadas apenas transitoriamente46,47, enquanto podem ser mantidas de forma estável nas câmaras de gravação de interface10,48,49. Como tal, muitos estudos de atividade espontânea complexa in vitro têm se apoiado em câmaras de gravação de interface para investigar complexos de ondas agudas6,7,8,9,10,25,37, oscilações gama10,13, e atividade epilépforma16,38,45,47.
Em uma câmara de gravação de estilo submerso, um objetivo de microscópio de imersão pode ser usado para visualizar células individuais e direcionar seletivamente células de aparência saudável para gravações. A preparação submersa também permite um bom controle sobre o meio celular, pois a submersão facilita a rápida difusão de drogas ou outros compostos para o tecido. Assim, uma metodologia modificada na qual as oscilações estáveis da rede são mantidas em condições submersas representa uma abordagem experimental poderosa. Esta abordagem é exemplificada pelo trabalho de Hájos et al., no qual as fatias hipocampais se recuperam em uma câmara de retenção simplificada no estilo interface por várias horas antes da transferência para uma câmara de gravação submersa modificada com uma alta taxa de fluxo de ACSF (~6 mL/min) para aumentar o fornecimento de oxigênio ao tecido12,48,49. Nessas condições, altos níveis de atividade interneuron e oscilações estáveis da rede espontânea podem ser mantidos em uma câmara de gravação submersa. Esta abordagem modificada permite que os pesquisadores realizem gravações de grampos de remendo de células inteiras visualmente guiadas e caracterizem a contribuição de tipos de células morfologicamente identificadas para as oscilações gama induzidas por carbachol12. SwRs também podem ocorrer espontaneamente em fatias hipocampais submersas com uma taxa de fluxo rápida de ACSF11,48,49. Maier et al. demonstraram que as fatias hipocampais que se recuperaram em uma câmara de interface antes da transferência para uma câmara de gravação submersa exibiam de forma confiável SWRs espontâneas, enquanto as fatias que se recuperavam submersas em um béquer antes da transferência para uma câmara de gravação submersa apresentaram respostas de campo evocadas menores, níveis mais baixos de correntes sinápticas espontâneas, e apenas muito raramente exibiam SWRs espontâneos43. Schlingloff et al. utilizaram essa metodologia aprimorada para demonstrar o papel das células cestos expressas por parvalbumin na geração de SWRsespontâneas 44.
O protocolo a seguir apresenta um método de corte através do qual neurônios espontaneamente ativos em fatias hipocampais horizontais podem ser recuperados em condições de interface e posteriormente mantidos em uma câmara de gravação submersa adequada para manipulações farmacológicas ou optogenéticas e gravações visualmente guiadas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

O corte cerebral de roedores agudos oferece uma abordagem experimental tratável para obter uma visão sobre a organização e função de circuitos neurais com resolução unicelular usando eletrofisiologia, microscopia e farmacologia. No entanto, uma grande consideração no desenho de experimentos in vitro é a extensão em que diferentes preparações de fatias recapitulam padrões naturalistas da atividade neural como observado in vivo. No cérebro intacto, a rede hipocampal gera atividade populacional altamente sincronizada refletindo o estado comportamental do animal, como exemplificado pelos complexos de ondas agudas (SWRs) que ocorrem durante o despertar de estados consumados ou sono não-REM. SWRs e outras formas de atividade de rede podem surgir espontaneamente em fatias hipocampais isoladas em condições apropriadas. Para aplicar o poderoso kit de ferramentas de fatia cerebral à investigação da atividade da rede hipocampal, é necessário utilizar uma abordagem que otimize a saúde do tecido e a preservação da conectividade funcional dentro da rede hipocampal. Os camundongos são transcardialmente perfundidos com fluido cerebrospinal artificial à base de sacarose fria. As fatias horizontais contendo o hipocampo são cortadas a uma espessura de 450 μm para preservar a conectividade sináptica. As fatias se recuperam em uma câmara estilo interface e são transferidas para uma câmara submersa para gravações. A câmara de gravação foi projetada para superfusão de superfície dupla de fluido cerebrospinal artificial a uma alta taxa de fluxo para melhorar a oxigenação da fatia. Este protocolo produz tecido saudável adequado para a investigação de atividades complexas e espontâneas da rede in vitro.

Apresentados aqui estão gravações representativas de fatias hec preparadas como descrito neste protocolo. Após a recuperação em uma câmara de retenção de interface(Figura 1C),as fatias são transferidas individualmente para uma câmara de gravação submersa(Figura 2B). A câmara de gravação é fornecida com ACSF saturada de carbogênio usando uma bomba peristáltica(Figura 2A). A bomba primeiro atrai ACSF de um béquer d...

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Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Este protocolo descreve a preparação de fatias horizontais do córtex hipocampal-entorhinal (HEC) de camundongos que exibem atividade espontânea de ondulação de ondas afiadas. As fatias são incubadas em uma câmara de realização de interface simplificada e as gravações são realizadas em condições submersas com fluido cerebrospinal artificial de fluxo rápido para promover a oxigenação tecidual e o surgimento espontâneo da atividade em nível de rede.

Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Using this protocol, researchers can investigate the mechanisms underlying hippocampal network oscillations in acute mouse brain slice preparations. In this preparation, recordings are performed under submerged conditions in slices generating spontaneous network oscillations, allowing pharmacological and optogenetic techniques to be performed, and single-cell recordings to be visualized. For transcardial perfusion, immediately before removing the mouse from the isoflurane chamber, fill a Petri dish lid with three to five millimeters of chilled sucrose solution, and fill the Petri dish bottom with approximately one centimeter of chilled sucrose solution.Quickly transfer the anesthetized mouse to the left absorbent pad, and use three pieces of tape to secure the forelimbs and tail. Using large tissue forceps and surgical scissors, tent the skin and make a lengthwise incision from the bottom of the sternum to the top of the chest. Use the forceps to pull up on the sternum and use the scissors to cut through the diaphragm.Use the scissors to cut through the rib cage on each side in one large motion toward the point at which the forelimb meets the body, and use the forceps to position the front of the rib cage toward the head. Use the scissors to make a horizontal cut to completely remove the ribs, and use the forceps to hold the heart in place while inserting a 20-gauge perfusion needle into the left ventricle. When the needle is in place, use small dissection scissors to make an incision in the right atrium, and allow the blood to be flushed out of the circulatory system.To extract the brain, after decapitation, use small bond scissors to make two lateral cuts through the skull toward the midline at the front of the skull near the eyes, and make two additional cuts on either side of the base of the skull. Immerse the head in the glass Petri dish, and use the scissors to cut along the midline across the entire length of the skull, while pulling up with the scissors to minimize damage to the underlying brain tissue. Use small tissue forceps to firmly grasp each side of the skull, and to lift the bone up and away from the brain to open the cranium like a book.Using the fingers of the left hand to hold the flaps of the skull open, insert the microspatula under the brain near the olfactory bulbs, and flip the brain out of the skull into the sucrose. Use the microspatula to sever the brainstem, and wash the brain to remove any residual blood, fur, or tissues. Use the large spatula to transfer the brain to the glass Petri dish lid, and use half of a double-edged razor blade to make a coronal cut in the most anterior portion of the brain, including the olfactory bulbs.Next, make a coronal cut to remove the cerebellum, and apply cyanoacrylate adhesive to an agar ramp. Use forceps to briefly dry the brain on a piece of filter paper, before placing the tissue into the adhesive on the agar ramp, ventral-side down. Place the slicing platform into the slicing chamber of a microtome, and completely cover the setup with chilled sucrose solution.Use the large spatula to stir some sucrose slurry into the chamber, melting any frozen sucrose and rapidly bringing down the mixture temperature to one to two degrees Celsius. Cut slices to a thickness of 450 microns at 0.07 millimeters per second slicing speed. As each slice is freed, use the small-tissue forceps and a sharp scalpel to separate the two hemispheres, and to cut away tissue until the slice consists primarily of the hippocampus and perihippocampal regions.Use a plastic transfer pipette to transfer the slices individually to an interface recovery chamber containing warmed aCSF. With the slices positioned at the interface of the aCSF and air, and with only a thin meniscus of aCSF covering the slices. When all of the slices have been acquired, tightly close the chamber to allow the slices to recover at 32 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of the recovery period, place the chamber on a stirrer set to a slow speed to promote aCSF circulation within the chamber. To record local field potentials, fill a 400 milliliter beaker with carbogen-bubbled aCSF, and place one end of the pump tubing into the beaker. Turn on a peristaltic pump at 8 to 10 milliliters per minute to direct aCSF from the 400 milliliter beaker to a heated reservoir, and from the reservoir to the recording chamber at 32 degrees Celsius.Next, briefly clamp the tubing and turn off the pump to pause the flow. Using fine forceps, transfer a brain tissue slice to the recording chamber by the corner of the lens paper the tissue is resting on, slice down. Peel away the lens paper, leaving the slice emerged in the recording chamber, and use a harp to secure the slice.Using a manual micromanipulator, slowly advance the tip of a sodium chloride-filled stimulation pipette into the surface of the slice at a 30 to 45 degree angle, then use a second micromanipulator to slowly advance the tip of an aCSf-filled local field potential pipette into the region of interest at a 30 to 45 degree angle, and record the local field potential of the sample according to standard protocols. In this figure, representative recordings from hippocampal entorhinal cortex slices, prepared according to the protocol as demonstrated, can be observed. In healthy slices, electrical stimulation should produce a field post-synaptic potential with a small pre-synaptic fiber volley and a large post-synaptic potential with a rapid initial descent.Spontaneous sharp-wave ripples should also be visible as positive deflections in the local field potential in the stratum pyramidale. In suboptimal slices, evoked field post-synaptic potentials demonstrate a large fiber volley, and a relatively small post-synaptic potential, and such slices do not exhibit spontaneous sharp-wave ripples. In vitro sharp-wave ripples demonstrate a positive field potential in the stratum pyramidale layer, with an overlaid high-frequency oscillation paired with a negative field potential in the stratum radiatum layer.As illustrated, sharp-wave ripples in hippocampal entorhinal cortex slices originate within CA2/CA3 recurrent circuits, and propagate to CA1. It is essential to bubble carbogen into the solutions throughout the procedure, to ensure that the sucrose solution is chilled, and to perform each step as quickly as possible. After preparing these slices, extracellular or intracellular recordings can be performed, along with optogenetic or pharmacological experiments to determine how different cell types contribute to the function of neural networks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

Combinando Estimulação Magnética Transcraniana e fMRI para o Exame da rede de modo padrão

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Neurociência

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

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Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Agudo Adulto Cérebro Cortando na temperatura fisiológica

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

A indução de um Estado Isoeléctrico cérebro para investigar o impacto da endógena Synaptic Activity na excitabilidade neuronal<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...