Name: acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

El autor quiere agradecer a Steve Siegelbaum por su apoyo. La financiación es proporcionada por 5R01NS106983-02, así como 1 F31 NS113466-01.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia (AC-AAAU9451).
1. Preparar soluciones
<ol><li>Preparar solución de corte de sacarosa para cortar como se describe en la Tabla 1. NOTA: Después de preparar 1 L de solución de sacarosa, congele una pequeña cantidad (aproximadamente 100-200 ml) en una bandeja de hielo. Estos cubitos de hielo de sacarosa congelados ...

Hay varios pasos en este protocolo de corte diseñado para promover la salud de los tejidos y favorecer la aparición de la actividad espontánea de la red naturalista: el ratón se perfunde transcardialmente con solución de corte de sacarosa refrigerada; las rodajas de corteza horizontal-entorrinaal (HEC) se cortan a un espesor de 450 μm del hipocampo intermedio o ventral; las rodajas se recuperan en la interfaz de acsf calentado y aire humidificado, rico en carbohidratos; durante las grabaciones, las rodajas se sobre...

La medición electrofisiológica de las rodajas de hipocampo vivos in vitro es un potente enfoque experimental con numerosas ventajas. El experimentador puede utilizar un microscopio, micromanipuladores y un sistema de grabación para visualizar y recopilar directamente mediciones de neuronas individuales en el tejido. Las rodajas de tejido también son muy accesibles para la fototimulación o la administración de fármacos para experimentos optogenéticos, químicos o farmacológicos.
La red hipocampal genera una actividad poblacional altamente sincrónica in vivo,visible como oscilaciones en el potencial de campo local extracelular1,2,3,4,5. Los métodos de corte cerebral se han aprovechado para obtener información sobre los mecanismos celulares y de circuito subyacentes a estas oscilaciones de la red neuronal. El trabajo fundacional de Maier et al. demostró que los complejos afilados de onda-ondulación (SWR) pueden emerger espontáneamente en rodajas del hipocampo ventral6,7. Estudios posteriores de múltiples investigadores han aclarado gradualmente muchos aspectos de los SWR, incluyendo el papel de los neuromoduladores en la regulación del estado de red del hipocampo8,9,10 y los mecanismos sinápticos que impulsan la reactivación in vitro de conjuntos neuronales previamente activos durante el comportamiento in vivo11. Los experimentos de corte cerebral también han proporcionado información sobre la oscilación del rango gamma (30-100 Hz), un estado de red hipocampal distinto que se cree que admite la codificación de memoria y la recuperación12,13. Por último, reconociendo el papel central del hipocampo y las estructuras asociadas en la fisiopatología de la epilepsia del lóbulo temporal14,15,los investigadores han utilizado preparaciones de rebanadas de hipocampo para investigar la generación y propagación de la actividad epileptiforme. Carter y otros demostraron que las rodajas combinadas de corteza hipocampal-entorrinal preparadas a partir de animales crónicamente epilépticos pueden generar espontáneamente descargas epileptiformes in vitro16. Posteriormente, Karlócai et al. exploró los mecanismos subyacentes a las descargas epileptiformes en rodajas de hipocampo mediante el uso de líquido cefalorraquídeo artificial modificado (ACSF) con concentraciones de iones alteradas (mg2+ reducido o K+elevado) o medicamentos añadidos (4AP o gabazina)17.
Los investigadores han desarrollado numerosos enfoques de rebanadas de hipocampo que difieren de maneras clave: (1) la región del hipocampo contenida en la rebanada (dorsal, intermedia o ventral); 2) la presencia o ausencia de tejidos extrahippocampales como la corteza entorrina; (3) la orientación utilizada para cortar rodajas (coronales, sagitales, horizontales u oblicuas); y (4) las condiciones en las que se mantiene el tejido después del corte (sumergido completamente en ACSF o mantenido en la interfaz de ACSF y aire humidificado y rico en carbohidratos).
La elección de qué enfoque de corte debe determinarse mediante el objetivo experimental. Por ejemplo, las rodajas transversales o coronales del hipocampo dorsal mantenido en condiciones sumergidas se han utilizado muy eficazmente para la investigación de circuitos intrahippocampales y plasticidad sináptica18,19,20. Sin embargo, tales preparaciones no generan espontáneamente oscilaciones de red tan fácilmente como las rebanadas del hipocampo ventral21,22,23. Aunque un estado de actividad persistente de SWR puede ser inducido por estimulación tetánica en rodajas transversales del hipocampo dorsal y ventral24,los SWR espontáneos se observan más fácilmente en las rodajas ventrales7,25.
Una distinción fisiológica y anatómica inherente entre el hipocampo dorsal y ventral está respaldada por estudios realizados tanto in vivo como in vitro26. Las grabaciones en ratas revelaron ritmos theta fuertemente coherentes a lo largo del hipocampo dorsal e intermedio, pero mala coherencia entre la región ventral y el resto del hipocampo27. Los SWR in vivo se propagan fácilmente entre el hipocampo dorsal e intermedio, mientras que los SWR que se originan en el hipocampo ventral a menudo permanecen locales28. Las proyecciones asociacionales originadas a partir de neuronas piramidales CA3 que residen en el hipocampo dorsal e intermedio proyectan largas distancias a lo largo del eje longitudinal del hipocampo. Las proyecciones ca3 procedentes de regiones ventrales siguen siendo relativamente locales y, por lo tanto, tienen menos probabilidades de ser cortadas durante el proceso de corte29,30. Por lo tanto, las rodajas ventrales pueden conservar mejor la red recurrente necesaria para generar sincronia de población. La propensión de las rodajas ventrales a generar actividades espontáneas de red in vitro también puede reflejar una mayor excitabilidad intrínseco de las neuronas piramidales o una inhibición GABAérgica más débil en el hipocampo ventral en comparación con las regiones más dorsales31. De hecho, las rodajas de hipocampo ventral son más susceptibles a la actividad epileptiforme32,33. Así, muchos estudios de oscilaciones fisiológicas espontáneas de red8,9,11,24 o patológicas16,34,35,36 han utilizado tradicionalmente un enfoque de corte horizontal, a veces con un ligero ángulo en la dirección fronto-occipital, que produce rodajas de tejido paralelas al plano transversal del hipocampo ventral.
La conectividad de red se ve inevitablemente afectada por el procedimiento de corte, ya que muchas celdas del sector se cortarán. El ángulo y el grosor de la rebanada y el tejido retenido en la preparación deben considerarse para optimizar la conectividad en los circuitos de interés. Muchos estudios han utilizado rodajas horizontales combinadas de corteza hipocampal-entorrinales (HEC) para explorar interacciones entre las dos estructuras en el contexto de oscilaciones fisiológicas o patológicas de la red. Roth et al. realizaron grabaciones duales desde el subcampo CA1 del hipocampo y la capa V de la corteza entorrinal medial para demostrar la propagación de la actividad SWR a través de la rebanadaHEC 37. Muchos estudios de actividad epileptiforme han utilizado la preparación de la rebanada HEC para investigar cómo se propagan las descargas epileptiformes a través de la red corticohippocampal16,35,36,38. Es importante tener en cuenta que la preservación del bucle corticohippocampal intacto no es un requisito previo para los SWR espontáneos, descargas epileptiformes o oscilaciones gamma; las oscilaciones de red se pueden generar en rodajas transversales del hipocampo dorsal o ventral sin tejidos parahippocampales unidos21,22,23, 25,39,40,41. Un factor más importante para la generación espontánea de oscilaciones de red en rodajas de hipocampo puede ser el grosor de cada rebanada, ya que una rebanada más gruesa (400-550 μm) preservará más conectividad en la red recurrente CA2/CA321,22,25.
Aunque se han utilizado rodajas HEC horizontales en ángulo (cortadas con un ángulo aproximado de 12° en la dirección fronto-occipital) para estudiar la conectividad funcional del bucle corticohippocampal11,16,34,35,42,tales preparaciones en ángulo no son necesarias para la actividad espontánea de la red43,44,45. Sin embargo, el uso de un plano de corte en ángulo permite al investigador hacer selectivamente rodajas que conserven mejor las lamellas orientadas transversalmente del hipocampo ventral o intermedio, dependiendo de si se aplica un ángulo hacia abajo o hacia arriba(Figura 1). Este enfoque es conceptualmente similar al utilizado por Papatheodoropoulos et al., 2002, que diseccionó cada hipocampo libre y luego utilizó un helicóptero de tejido para crear rodajas transversales a lo largo de todo el eje dorsal-ventral21. A la luz de las distinciones funcionales antes mencionadas entre el hipocampo ventral y dorsal-intermedio, los investigadores deben considerar el origen anatómico de las rodajas al diseñar experimentos o interpretar resultados. El uso de una rampa de agar durante el procedimiento de corte es una manera sencilla de producir preferentemente rodajas del hipocampo intermedio o ventral.
Las rodajas de hipocampo se pueden mantener en una cámara sumergida (con el tejido completamente sumergido en ACSF), o una cámara de estilo interfaz (por ejemplo, cámara Oslo o Haas, con rodajas cubiertas sólo por una fina película de medios que fluyen). El mantenimiento de la interfaz mejora la oxigenación del tejido, que promueve la supervivencia neuronal y permite niveles altos sostenidos de actividad interneuronal. Tradicionalmente, las condiciones de registro sumergidas utilizan un caudal de ACSF más lento que no proporciona una oxigenación adecuada del tejido para una expresión estable de las oscilaciones a nivel de red. En las rodajas de hipocampo sumergido oscilaciones gamma inducidas por carbachol sólo se observan transitoriamente46,47, mientras que se pueden mantener establemente en las cámaras de grabación de interfaz10,48,49. Como tal, muchos estudios de actividad espontánea compleja in vitro se han basado en cámaras de registro de interfaz para investigar complejos de ondulación de ondulación aguda6,7,8,9,10,25,37,oscilaciones gamma10,13,y actividad epileptiforme16,38,45,47.
En una cámara de grabación de estilo sumergido, se puede utilizar un objetivo de microscopio de inmersión para visualizar células individuales y dirigirse selectivamente a células de aspecto saludable para grabaciones. La preparación sumergida también permite un control fino sobre el entorno celular, ya que la inmersión facilita la rápida difusión de fármacos u otros compuestos al tejido. Por lo tanto, una metodología modificada en la que se mantienen oscilaciones estables de la red en condiciones sumergidas representa un enfoque experimental potente. Este enfoque se ejemplifica con el trabajo de Hájos et al., en el que las rodajas de hipocampo se recuperan en una cámara de sujeción simplificada de estilo interfaz durante varias horas antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida modificada con un alto caudal de ACSF (~6 mL/min) para mejorar el suministro de oxígeno al tejido12,48,49. En estas condiciones, se pueden mantener altos niveles de actividad interneuron y oscilaciones espontáneas estables de la red en una cámara de grabación sumergida. Este enfoque modificado permite a los investigadores realizar grabaciones de abrazaderas de parches de células enteras guiadas visualmente y caracterizar la contribución de los tipos celulares identificados morfológicamente a las oscilaciones gamma inducidas por carbachol12. Los SWR también pueden ocurrir espontáneamente en rodajas de hipocampo sumergidas con un caudal rápido de ACSF11,48,49. Maier et al. demostraron que las rodajas de hipocampo que se recuperaban en una cámara de interfaz antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida mostraban de forma fiable swrs espontáneos, mientras que las rodajas que se recuperaban sumergidas en un vaso de precipitados antes de ser transferidas a una cámara de grabación sumergida mostraban respuestas de campo evocadas más pequeñas, niveles más bajos de corrientes sinápticas espontáneas, y sólo muy rara vez mostraban SWR espontáneos43. Schlingloff et al. utilizaron esta metodología mejorada para demostrar el papel de las células de cesta que expresan parvalbumina en la generación de SWRespontáneos 44.
El siguiente protocolo presenta un método de corte a través del cual las neuronas espontáneamente activas en rodajas de hipocampo horizontal pueden recuperarse en condiciones de interfaz y posteriormente mantenerse en una cámara de grabación sumergida adecuada para manipulaciones farmacológicas u optogenéticas y grabaciones guiadas visualmente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

El corte cerebral agudo de roedores ofrece un enfoque experimental tractable para obtener información sobre la organización y función de los circuitos neuronales con resolución unicelular mediante electrofisiología, microscopía y farmacología. Sin embargo, una consideración importante en el diseño de experimentos in vitro es hasta qué punto diferentes preparaciones de rebanadas recapitulan patrones naturalistas de actividad neuronal como se observa in vivo. En el cerebro intacto, la red de hipocampos genera una actividad poblacional altamente sincronizada que refleja el estado conductual del animal, como lo ejemplifican los complejos de ondulación de onda aguda (SWR) que se producen durante la vigilia de los estados consumados o el sueño no REM. Los SWR y otras formas de actividad de la red pueden surgir espontáneamente en rodajas de hipocampo aisladas en condiciones apropiadas. Con el fin de aplicar el potente kit de herramientas de corte cerebral a la investigación de la actividad de la red de hipocampo, es necesario utilizar un enfoque que optimice la salud de los tejidos y la preservación de la conectividad funcional dentro de la red del hipocampo. Los ratones se fusionan transcardialmente con líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa fría. Las rodajas horizontales que contienen el hipocampo se cortan a un espesor de 450 μm para preservar la conectividad sináptica. Los sectores se recuperan en una cámara de estilo interfaz y se transfieren a una cámara sumergida para grabaciones. La cámara de grabación está diseñada para la superfusión de doble superficie de líquido cefalorraquídeo artificial a un alto caudal para mejorar la oxigenación de la rebanada. Este protocolo produce tejido sano adecuado para la investigación de la actividad compleja y espontánea de la red in vitro.

Aquí se presentan grabaciones representativas de sectores HEC preparados como se describe en este protocolo. Después de la recuperación en una cámara de retención de interfaz (Figura 1C), los sectores se transfieren individualmente a una cámara de grabación sumergida (Figura 2B). La cámara de grabación se suministra con ACSF saturado de carbógeno utilizando una bomba peristáltica(Figura 2A). La bomba primero extrae ACSF d...

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Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Este protocolo describe la preparación de rodajas horizontales de corteza hipocampal-entorrinaal (HEC) de ratones que exhiben actividad espontánea de ondulación de onda aguda. Las rodajas se incuban en una cámara de retención de interfaz simplificada y las grabaciones se realizan en condiciones sumergidas con líquido cefalorraquídeo artificial de flujo rápido para promover la oxigenación tisular y la aparición espontánea de la actividad a nivel de red.

Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Using this protocol, researchers can investigate the mechanisms underlying hippocampal network oscillations in acute mouse brain slice preparations. In this preparation, recordings are performed under submerged conditions in slices generating spontaneous network oscillations, allowing pharmacological and optogenetic techniques to be performed, and single-cell recordings to be visualized. For transcardial perfusion, immediately before removing the mouse from the isoflurane chamber, fill a Petri dish lid with three to five millimeters of chilled sucrose solution, and fill the Petri dish bottom with approximately one centimeter of chilled sucrose solution.Quickly transfer the anesthetized mouse to the left absorbent pad, and use three pieces of tape to secure the forelimbs and tail. Using large tissue forceps and surgical scissors, tent the skin and make a lengthwise incision from the bottom of the sternum to the top of the chest. Use the forceps to pull up on the sternum and use the scissors to cut through the diaphragm.Use the scissors to cut through the rib cage on each side in one large motion toward the point at which the forelimb meets the body, and use the forceps to position the front of the rib cage toward the head. Use the scissors to make a horizontal cut to completely remove the ribs, and use the forceps to hold the heart in place while inserting a 20-gauge perfusion needle into the left ventricle. When the needle is in place, use small dissection scissors to make an incision in the right atrium, and allow the blood to be flushed out of the circulatory system.To extract the brain, after decapitation, use small bond scissors to make two lateral cuts through the skull toward the midline at the front of the skull near the eyes, and make two additional cuts on either side of the base of the skull. Immerse the head in the glass Petri dish, and use the scissors to cut along the midline across the entire length of the skull, while pulling up with the scissors to minimize damage to the underlying brain tissue. Use small tissue forceps to firmly grasp each side of the skull, and to lift the bone up and away from the brain to open the cranium like a book.Using the fingers of the left hand to hold the flaps of the skull open, insert the microspatula under the brain near the olfactory bulbs, and flip the brain out of the skull into the sucrose. Use the microspatula to sever the brainstem, and wash the brain to remove any residual blood, fur, or tissues. Use the large spatula to transfer the brain to the glass Petri dish lid, and use half of a double-edged razor blade to make a coronal cut in the most anterior portion of the brain, including the olfactory bulbs.Next, make a coronal cut to remove the cerebellum, and apply cyanoacrylate adhesive to an agar ramp. Use forceps to briefly dry the brain on a piece of filter paper, before placing the tissue into the adhesive on the agar ramp, ventral-side down. Place the slicing platform into the slicing chamber of a microtome, and completely cover the setup with chilled sucrose solution.Use the large spatula to stir some sucrose slurry into the chamber, melting any frozen sucrose and rapidly bringing down the mixture temperature to one to two degrees Celsius. Cut slices to a thickness of 450 microns at 0.07 millimeters per second slicing speed. As each slice is freed, use the small-tissue forceps and a sharp scalpel to separate the two hemispheres, and to cut away tissue until the slice consists primarily of the hippocampus and perihippocampal regions.Use a plastic transfer pipette to transfer the slices individually to an interface recovery chamber containing warmed aCSF. With the slices positioned at the interface of the aCSF and air, and with only a thin meniscus of aCSF covering the slices. When all of the slices have been acquired, tightly close the chamber to allow the slices to recover at 32 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of the recovery period, place the chamber on a stirrer set to a slow speed to promote aCSF circulation within the chamber. To record local field potentials, fill a 400 milliliter beaker with carbogen-bubbled aCSF, and place one end of the pump tubing into the beaker. Turn on a peristaltic pump at 8 to 10 milliliters per minute to direct aCSF from the 400 milliliter beaker to a heated reservoir, and from the reservoir to the recording chamber at 32 degrees Celsius.Next, briefly clamp the tubing and turn off the pump to pause the flow. Using fine forceps, transfer a brain tissue slice to the recording chamber by the corner of the lens paper the tissue is resting on, slice down. Peel away the lens paper, leaving the slice emerged in the recording chamber, and use a harp to secure the slice.Using a manual micromanipulator, slowly advance the tip of a sodium chloride-filled stimulation pipette into the surface of the slice at a 30 to 45 degree angle, then use a second micromanipulator to slowly advance the tip of an aCSf-filled local field potential pipette into the region of interest at a 30 to 45 degree angle, and record the local field potential of the sample according to standard protocols. In this figure, representative recordings from hippocampal entorhinal cortex slices, prepared according to the protocol as demonstrated, can be observed. In healthy slices, electrical stimulation should produce a field post-synaptic potential with a small pre-synaptic fiber volley and a large post-synaptic potential with a rapid initial descent.Spontaneous sharp-wave ripples should also be visible as positive deflections in the local field potential in the stratum pyramidale. In suboptimal slices, evoked field post-synaptic potentials demonstrate a large fiber volley, and a relatively small post-synaptic potential, and such slices do not exhibit spontaneous sharp-wave ripples. In vitro sharp-wave ripples demonstrate a positive field potential in the stratum pyramidale layer, with an overlaid high-frequency oscillation paired with a negative field potential in the stratum radiatum layer.As illustrated, sharp-wave ripples in hippocampal entorhinal cortex slices originate within CA2/CA3 recurrent circuits, and propagate to CA1. It is essential to bubble carbogen into the solutions throughout the procedure, to ensure that the sucrose solution is chilled, and to perform each step as quickly as possible. After preparing these slices, extracellular or intracellular recordings can be performed, along with optogenetic or pharmacological experiments to determine how different cell types contribute to the function of neural networks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

La combinación de Estimulación Magnética Transcraneal y fMRI para examinar la red en modo por defecto

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Investigación

Neurociencias

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

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Determinación de la actividad locomotora espontánea en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

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Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

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Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Inducción de un estado isoeléctrico cerebro para investigar el impacto de la actividad endógena sináptica neuronal en la excitabilidad<em&gt; En Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

Un modelo preclínico para evaluar la recuperación cerebral después de un accidente cerebrovascular agudo en ratas

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Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

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