Name: acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Författaren vill tacka Steve Siegelbaum för stödet. Finansieringen tillhandahålls av 5R01NS106983-02 samt 1 F31 NS113466-01.

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Columbia University (AC-AAAU9451).
1. Förbered lösningar
<ol><li>Bered sackarosskärningslösning för skivning enligt tabell 1. OBS: Efter att ha förberett 1 L sackaroslösning, frys in en liten mängd (ca 100–200 ml) i en isbricka. Dessa frusna sackarosisbitar blandas i ett isigt slam (se steg 4.3).</li>
	<li>Förbered konstgjord cerebrospinalvätska (AC...

Det finns flera steg i detta skivningsprotokoll som är utformat för att främja vävnadshälsa och gynna uppkomsten av spontan naturalistisk nätverksaktivitet: musen är transcardially perfused med kyld sackaros skärlösning; Horisontella entorhinal cortex (HEC) skivor skärs med en tjocklek av 450 μm från mellanliggande eller ventrala hippocampus; skivor återhämtar sig vid gränssnittet mellan uppvärmd ACSF och fuktad, karbinrik luft; Under inspelningarna överfuseras skivorna med ACSF som värms upp till 32 °...

Elektrofysiologisk mätning från levande hippocampala skivor in vitro är ett kraftfullt experimentellt tillvägagångssätt med många fördelar. Experimenteraren kan använda ett mikroskop, mikromanipulatorer och ett inspelningssystem för att direkt visualisera och samla mätningar från enskilda nervceller i vävnaden. Vävnadsskivor är också mycket tillgängliga för fotostimulering eller läkemedelsleverans för optogenetiska, chemogenetiska eller farmakologiska experiment.
Hippocampal nätverket genererar mycket synkron befolkning aktivitet in vivo, synlig som svängningar i det extracellulära lokala fältet potential1,2,3,4,5. Brain slice metoder har utnyttjats för att få insikt i cellulära och krets mekanismer som ligger till grund för dessa neuronala nätverk svängningar. Grundläggande arbete från Maier et al. visade att skarpa våg-ripple komplex (SWRs) kan dyka upp spontant i skivor av ventral hippocampus6,7. Efterföljande studier från flera utredare har gradvis klarlagt många aspekter av SWR, inklusive neuromodulatorernas roll i att reglera nätverkstillståndet för hippocampus8,9,10 och de synaptiska mekanismerna som driver in vitro-återaktivering av neuronala ensembler som tidigare var aktiva under beteende in vivo11. Hjärnsegmentexperiment har också gett insikt i gammaområdets svängning (30–100 Hz), ett distinkt hippocampalt nätverkstillstånd som tros stödja minneskodning ochåterkalla 12,13. Slutligen, erkänner hippocampus centrala roll och associerade strukturer i patofysiologin för temporal lob epilepsi14,15, forskare har använt hippocampal slice preparat för att undersöka generering och spridning av epileptiform aktivitet. Carter et al. visat att kombinerade hippocampal-entorhinal cortex skivor beredda från kroniskt epileptiska djur kan spontant generera epileptiform utsläpp in vitro16. Därefter undersökte Karlócai et al. mekanismerna bakom epileptiforma utsläpp i hippocampal skivor med hjälp av modifierad konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) med ändrade jonkoncentrationer (minskad Mg2 + eller förhöjd K+) eller tillsatta läkemedel (4AP eller gabazin)17.
Utredare har utvecklat många hippocampal slice metoder som skiljer sig åt på viktiga sätt: (1) regionen hippocampus som finns i skivan (dorsala, mellanliggande eller ventrala); (2) Förekomst eller frånvaro av extrahippocampala vävnader såsom entorhinal cortex. (3) Den orientering som används för att skära skivor (koronal, sagittal, horisontell eller sned); och (4) de förhållanden under vilka vävnaden bibehålls efter skivning (helt nedsänkt i ACSF eller hålls i gränslandet mellan ACSF och fuktad, karbinrik luft).
Valet av vilken skivningsstrategi som ska användas bör bestämmas av försöksmålet. Till exempel har tvärgående eller koronala skivor av dorsala hippocampus som upprätthålls under nedsänkta förhållanden använts mycket effektivt för undersökning av intrahippocampalkretsar och synaptisk plasticitet18,19,20. Sådana preparat genererar dock inte spontant nätverksoscillationer lika lätt som skivor från ventral hippocampus21,22,23. Även om ett tillstånd av ihållande SWR-aktivitet kan induceras av ttanisk stimulering i tvärgående skivor från dorsala och ventrala hippocampus24, observeras spontana SWR lättare i ventralaskivor 7,25.
En inneboende fysiologisk och anatomisk skillnad mellan dorsala och ventrala hippocampus stöds av studier som utförs både in vivo och in vitro26. Inspelningar hos råttor visade starkt sammanhängande theta rytmer i hela dorsala och mellanliggande hippocampus, men dålig sammanhållning mellan ventral regionen och resten av hippocampus27. STÅL in vivo förökar sig lätt mellan dorsala och mellanliggande hippocampus, medan SWR som har sitt ursprung i ventral hippocampus ofta förblir lokala28. De associationsprojektioner som härrör från CA3 pyramidala nervceller som bor i dorsala och mellanliggande hippocampus projektet långa avstånd längs hippocampus längs längsgående axeln. CA3-prognoser från ventrala regioner är fortfarande relativt lokala och är därför mindre benägna att skäras av under skivningsprocessen29,30. Ventrala skivor kan därför bättre bevara det återkommande nätverk som krävs för att generera befolkningssynkronisering. Benägenheten hos ventrala skivor att generera spontana nätverksaktiviteter in vitro kan också återspegla högre inneboende excitabilitet av pyramidala nervceller eller svagare GABAergic hämning i ventrala hippocampus jämfört med mer dorsala regioner31. Faktum är att ventrala hippocampal skivor är mer mottagliga för epileptiform aktivitet32,33. Således har många studier av spontanafysiologiska 8,9,11,24 eller patologiska16,34,35,36 nätverkssvängningar traditionellt använt en horisontell skivning, ibland med en liten vinkel i fronto-occipital riktningen, vilket ger vävnadsskivor parallellt med ventrala hippocampus tvärplan.
Nätverksanslutningen påverkas oundvikligen av skivningsproceduren eftersom många celler i segmentet kommer att skäras av. Vinkeln och tjockleken på skivan och vävnaden som behålls i preparatet bör övervägas för att optimera anslutningen i kretsarna av intresse. Många studier har använt horisontella kombinerade hippocampal-entorhinal cortex skivor (HEC) för att utforska interaktioner mellan de två strukturerna i samband med fysiologiska eller patologiska nätverk svängningar. Roth et al. utförde dubbla inspelningar från CA1-delfältet i hippocampus och lager V av den mediala entorhinala cortex för att demonstrera spridning av SWR-aktivitet genom HEC-skivan37. Många studier av epileptiform aktivitet har använt HEC skiva förberedelse för att undersöka hur epileptiform utsläpp sprider sig genom corticohippocampal nätverk16,35,36,38. Det är viktigt att notera att bevarandet av den intakta corticohippocampal slingan inte är en förutsättning för spontana SWRs, epileptiform urladdningar eller gamma svängningar. nätverkssvängningar kan genereras i tvärgående skivor av dorsala eller ventrala hippocampus utan bifogade parahippocampalvävnader 21,22,23, 25,39,40,41. En viktigare faktor för den spontana generationen av nätverkssvängningar i hippocampal skivor kan vara tjockleken på varje skiva, eftersom en tjockare skiva (400-550 μm) kommer att bevara mer anslutning i CA2 / CA3 återkommande nätverk21,22,25.
Även om vinklade horisontella HEC-skivor (skurna med en cirka 12° vinkel i fronto-occipital riktning) har använts för att studera den funktionella anslutningen av corticohippocampalslingan 11,16,34,35,42, krävs sådana vinklade preparat inte för spontannätverksaktivitet 43,44,45. Användningen av ett vinklat skivplan gör det dock möjligt för prövaren att selektivt göra skivor som bäst bevarar de tvärgående orienterade lamellerna i antingen ventrala eller mellanliggande hippocampus, beroende på om en nedåt- eller uppåtriktad vinkel appliceras (figur 1). Detta tillvägagångssätt är konceptuellt likt det som används av Papatheodoropoulos et al., 2002, som dissekerade varje hippocampusfri och sedan använde en vävnadshacker för att skapa tvärgående skivor längs hela dorsala-ventrala axeln21. Mot bakgrund av de ovannämnda funktionella skillnaderna mellan ventrala och dorsala-mellanliggande hippocampus, bör utredare överväga anatomiska ursprunget för skivor när man utformar experiment eller tolkar resultat. Att använda en agarramp under skivningsproceduren är ett enkelt sätt att företrädesvis producera skivor från antingen mellanliggande eller ventral hippocampus.
Hippocampalskivor kan bibehållas i antingen en nedsänkt kammare (med vävnaden helt nedsänkt i ACSF) eller en kammare i gränssnittsstil (t.ex. Oslo eller Haas kammare, med skivor som endast täcks av en tunn film av flödande media). Gränssnittsunderhåll förbättrar syresättningen av vävnaden, vilket främjar neuronal överlevnad och möjliggör ihållande höga nivåer av interneuronal aktivitet. Traditionellt använder nedsänkta inspelningsförhållanden ett långsammare ACSF-flöde som inte ger tillräcklig vävnadssyresättning för stabilt uttryck av svängningar på nätverksnivå. I nedsänkta hippocampal skivor observeras carbachol-inducerad gamma oscillations endastövergående 46,47, medan de kan hållas stabilt i gränssnitt inspelningskammare10,48,49. Som sådan har många studier av komplex spontan aktivitet in vitro förlitat sig på gränssnitt inspelningskammare för att undersöka skarpa våg krusning komplex6,7,8,9,10,25,37, gamma svängningar10,13, och epileptiform aktivitet16,38,45,47.
I en inspelningskammare i nedsänkt stil kan ett nedsänkningsmikroskopmål användas för att visualisera enskilda celler och selektivt rikta in sig på friska celler för inspelningar. Den nedsänkta beredningen möjliggör också fin kontroll över cellmiljön, eftersom nedsänkning underlättar snabb diffusion av droger eller andra föreningar till vävnaden. Således utgör en modifierad metod där stabila nätverkssvängningar upprätthålls under nedsänkta förhållanden ett kraftfullt experimentellt tillvägagångssätt. Detta tillvägagångssätt exemplifieras av arbetet i Hájos et al., där hippocampal skivor återhämtar sig i en förenklad gränssnittsliknande hållkammare i flera timmar innan de överförs till en modifierad nedsänkt inspelningskammare med ett högt flöde av ACSF (~ 6 ml / min) för att förbättra syretillförselntill vävnaden 12,48,49. Under dessa förhållanden kan höga nivåer av interneuron aktivitet och stabila spontana nätverk svängningar upprätthållas i en nedsänkt inspelningskammare. Detta modifierade tillvägagångssätt gör det möjligt för utredarna att utföra visuellt guidade hela cell patch clamp inspelningar och karakterisera bidraget från morfologiskt identifierade celltyper till carbachol-inducerad gamma svängningar12. SWR kan också uppstå spontant i nedsänkta hippocampal skivor med en snabb flödeshastighet av ACSF11,48,49. Maier et al. visade att hippocampala skivor som återhämtade sig i en gränssnittskammare innan de överfördes till en nedsänkt inspelningskammare på ett tillförlitligt sätt uppvisade spontana SWR, medan skivor som återhämtade sig nedsänkta i en bägare före överföring till en nedsänkt inspelningskammare visade mindre framkallade fältsvar, lägre nivåer av spontana synaptiska strömmar och endast mycket sällan uppvisade spontana SWRs43. Schlingloff et al. använde denna förbättrade metodik för att demonstrera rollen av parvalbumin-uttrycka korgceller i genereringen av spontana SWRs44.
Följande protokoll presenterar en skivningsmetod genom vilken spontant aktiva nervceller i horisontella hippocampal skivor kan återvinnas under gränssnittsförhållanden och därefter upprätthållas i en nedsänkt inspelningskammare lämplig för farmakologiska eller optogenetiska manipuleringar och visuellt guidade inspelningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

Akut gnagarhjärnslicing erbjuder ett dragbart experimentellt tillvägagångssätt för att få insikt i organisationen och funktionen hos neurala kretsar med encellsupplösning med hjälp av elektrofysiologi, mikroskopi och farmakologi. En viktig faktor i utformningen av in vitro-experiment är dock i vilken utsträckning olika segmentpreparat rekapitulerar naturalistiska mönster av neural aktivitet som observerats in vivo. I den intakta hjärnan genererar hippocampal-nätverket mycket synkroniserad populationsaktivitet som återspeglar djurets beteendetillstånd, vilket exemplifieras av de skarpa våg kruskomplexen (SWR) som uppstår under vakna fullbordanstillstånd eller icke-REM-sömn. Stållinor och andra former av nätverksaktivitet kan dyka upp spontant i isolerade hippocampalskivor under lämpliga förhållanden. För att tillämpa den kraftfulla verktygslådan för hjärnskivor på undersökningen av hippocampal nätverksaktivitet är det nödvändigt att använda ett tillvägagångssätt som optimerar vävnadshälsan och bevarandet av funktionell anslutning inom hippocampal-nätverket. Möss är transcardially perfused med kall sackaros-baserade konstgjorda cerebrospinal vätska. Horisontella skivor som innehåller hippocampus skärs med en tjocklek av 450 μm för att bevara synaptisk anslutning. Segment återställs i en kammare i gränssnittsstil och överförs till en nedsänkt kammare för inspelningar. Inspelningskammaren är utformad för dubbel ytsmfusion av konstgjord cerebrospinalvätska med hög flödeshastighet för att förbättra syresättningen av skivan. Detta protokoll ger frisk vävnad som är lämplig för undersökning av komplexa och spontana nätverksaktivitet in vitro.

Presenteras här är representativa inspelningar från HEC-segment som utarbetats enligt beskrivningen i detta protokoll. Efter återvinning i en gränssnittskammare(figur 1C)överförs skivorna individuellt till en nedsänkt inspelningskammare(figur 2B). Inspelningskammaren levereras med karbagenmättad ACSF med hjälp av en peristaltisk pump (figur 2A). Pumpen drar först ACSF från en håll bägare i en uppvärmd reservoar. Carbo...

Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Detta protokoll beskriver beredningen av horisontella hippocampal-entorhinal cortex (HEC) skivor från möss uppvisar spontana skarpa våg krusning verksamhet. Skivor inkuberas i en förenklad gränssnittskammare och inspelningar utförs under nedsänkta förhållanden med snabbt strömmande konstgjord cerebrospinalvätska för att främja vävnad syresättning och spontana uppkomsten av nätverksaktivitet.

Akut mushjärnslicing för att undersöka spontan hippocampal nätverksaktivitet

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Using this protocol, researchers can investigate the mechanisms underlying hippocampal network oscillations in acute mouse brain slice preparations. In this preparation, recordings are performed under submerged conditions in slices generating spontaneous network oscillations, allowing pharmacological and optogenetic techniques to be performed, and single-cell recordings to be visualized. For transcardial perfusion, immediately before removing the mouse from the isoflurane chamber, fill a Petri dish lid with three to five millimeters of chilled sucrose solution, and fill the Petri dish bottom with approximately one centimeter of chilled sucrose solution.Quickly transfer the anesthetized mouse to the left absorbent pad, and use three pieces of tape to secure the forelimbs and tail. Using large tissue forceps and surgical scissors, tent the skin and make a lengthwise incision from the bottom of the sternum to the top of the chest. Use the forceps to pull up on the sternum and use the scissors to cut through the diaphragm.Use the scissors to cut through the rib cage on each side in one large motion toward the point at which the forelimb meets the body, and use the forceps to position the front of the rib cage toward the head. Use the scissors to make a horizontal cut to completely remove the ribs, and use the forceps to hold the heart in place while inserting a 20-gauge perfusion needle into the left ventricle. When the needle is in place, use small dissection scissors to make an incision in the right atrium, and allow the blood to be flushed out of the circulatory system.To extract the brain, after decapitation, use small bond scissors to make two lateral cuts through the skull toward the midline at the front of the skull near the eyes, and make two additional cuts on either side of the base of the skull. Immerse the head in the glass Petri dish, and use the scissors to cut along the midline across the entire length of the skull, while pulling up with the scissors to minimize damage to the underlying brain tissue. Use small tissue forceps to firmly grasp each side of the skull, and to lift the bone up and away from the brain to open the cranium like a book.Using the fingers of the left hand to hold the flaps of the skull open, insert the microspatula under the brain near the olfactory bulbs, and flip the brain out of the skull into the sucrose. Use the microspatula to sever the brainstem, and wash the brain to remove any residual blood, fur, or tissues. Use the large spatula to transfer the brain to the glass Petri dish lid, and use half of a double-edged razor blade to make a coronal cut in the most anterior portion of the brain, including the olfactory bulbs.Next, make a coronal cut to remove the cerebellum, and apply cyanoacrylate adhesive to an agar ramp. Use forceps to briefly dry the brain on a piece of filter paper, before placing the tissue into the adhesive on the agar ramp, ventral-side down. Place the slicing platform into the slicing chamber of a microtome, and completely cover the setup with chilled sucrose solution.Use the large spatula to stir some sucrose slurry into the chamber, melting any frozen sucrose and rapidly bringing down the mixture temperature to one to two degrees Celsius. Cut slices to a thickness of 450 microns at 0.07 millimeters per second slicing speed. As each slice is freed, use the small-tissue forceps and a sharp scalpel to separate the two hemispheres, and to cut away tissue until the slice consists primarily of the hippocampus and perihippocampal regions.Use a plastic transfer pipette to transfer the slices individually to an interface recovery chamber containing warmed aCSF. With the slices positioned at the interface of the aCSF and air, and with only a thin meniscus of aCSF covering the slices. When all of the slices have been acquired, tightly close the chamber to allow the slices to recover at 32 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of the recovery period, place the chamber on a stirrer set to a slow speed to promote aCSF circulation within the chamber. To record local field potentials, fill a 400 milliliter beaker with carbogen-bubbled aCSF, and place one end of the pump tubing into the beaker. Turn on a peristaltic pump at 8 to 10 milliliters per minute to direct aCSF from the 400 milliliter beaker to a heated reservoir, and from the reservoir to the recording chamber at 32 degrees Celsius.Next, briefly clamp the tubing and turn off the pump to pause the flow. Using fine forceps, transfer a brain tissue slice to the recording chamber by the corner of the lens paper the tissue is resting on, slice down. Peel away the lens paper, leaving the slice emerged in the recording chamber, and use a harp to secure the slice.Using a manual micromanipulator, slowly advance the tip of a sodium chloride-filled stimulation pipette into the surface of the slice at a 30 to 45 degree angle, then use a second micromanipulator to slowly advance the tip of an aCSf-filled local field potential pipette into the region of interest at a 30 to 45 degree angle, and record the local field potential of the sample according to standard protocols. In this figure, representative recordings from hippocampal entorhinal cortex slices, prepared according to the protocol as demonstrated, can be observed. In healthy slices, electrical stimulation should produce a field post-synaptic potential with a small pre-synaptic fiber volley and a large post-synaptic potential with a rapid initial descent.Spontaneous sharp-wave ripples should also be visible as positive deflections in the local field potential in the stratum pyramidale. In suboptimal slices, evoked field post-synaptic potentials demonstrate a large fiber volley, and a relatively small post-synaptic potential, and such slices do not exhibit spontaneous sharp-wave ripples. In vitro sharp-wave ripples demonstrate a positive field potential in the stratum pyramidale layer, with an overlaid high-frequency oscillation paired with a negative field potential in the stratum radiatum layer.As illustrated, sharp-wave ripples in hippocampal entorhinal cortex slices originate within CA2/CA3 recurrent circuits, and propagate to CA1. It is essential to bubble carbogen into the solutions throughout the procedure, to ensure that the sucrose solution is chilled, and to perform each step as quickly as possible. After preparing these slices, extracellular or intracellular recordings can be performed, along with optogenetic or pharmacological experiments to determine how different cell types contribute to the function of neural networks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

Kombinera transkraniell magnetisk stimulering och fMRI för att undersöka nätverket standardläge

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bestämning av spontan rörelseaktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akut vuxna hjärnan Skivning i fysiologisk temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Immunohistokemisk Visualisering av hippocampus Neuron aktivitet Efter Spatial lärande i en musmodell av nervsystemets sjukdomar

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induktion av en Isoelectric hjärntillstånd för att undersöka inverkan av endogen Synaptic aktivitet på neuronala retbarhet<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Utvärdering av synaps densitet i hippocampus gnagare hjärnan skivor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

En preklinisk modell för att bedöma hjärn återhämtning efter akut stroke hos råttor

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Beredning av akut mänskliga Hippocampus skivor för elektrofysiologiska Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...