Name: acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Yazar, Steve Siegelbaum'a destek için teşekkür eder. Finansman 5R01NS106983-02 ve 1 F31 NS113466-01 tarafından sağlanmaktadır.

Burada açıklanan tüm yöntemler Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (AC-AAAU9451) tarafından onaylanmıştır.
1. Çözümler hazırlayın
<ol><li>Tablo 1'de açıklandığı gibi dilimleme için sakkaroz kesme çözeltisi hazırlayın. NOT: 1 L sakkaroz çözeltisi hazırladıktan sonra, bir buz tepsisinde az miktarda (yaklaşık 100-200 mL) dondurun. Bu donmuş sakkaroz buz küpleri buzlu bir bulamaç içine karışt?...

Doku sağlığını teşvik etmek ve spontan doğal ağ aktivitesinin ortaya çıkmasını desteklemek için tasarlanmış bu dilimleme protokolünde birkaç adım vardır: fare transkardiyel olarak soğutulmuş sakkaroz kesme çözeltisi ile perfüzyona sahiptir; yatay-entorhinal korteks (HEC) dilimleri ara veya ventral hipokampustan 450 μm kalınlığında kesilir; dilimler ısıtılmış ACSF ve nemlendirilmiş, karbojen bakımından zengin hava arayüzünde iyileşir; kayıt sırasında dilimler ACSF ile 32 ° C'ye ...

Canlı hipokampal dilimlerden in vitro elektrofizyolojik ölçüm, sayısız avantajı olan güçlü bir deneysel yaklaşımdır. Deneyci, dokudaki bireysel nöronlardan ölçümleri doğrudan görselleştirmek ve toplamak için bir mikroskop, mikromanipülatörler ve bir kayıt sistemi kullanabilir. Doku dilimleri ayrıca optogenetik, kemogenetik veya farmakolojik deneyler için fotostimülasyon veya ilaç teslimatı için çok erişilebilir.
Hipokampal ağ, hücredışı yerel alan potansiyeli 1 ,2,3,4,5'tesalınımlar olarak görülebilen vivo yüksek senkron nüfus aktivitesi oluşturur. Beyin dilimi yöntemleri, bu nöronal ağ salınımlarının altında kalan hücresel ve devre mekanizmaları hakkında fikir edinmek için yararlanmıştır. Maier ve ark.'ın temel çalışmaları, keskin dalga dalga komplekslerinin (SWR' ler) ventral hipokampus6,7dilimlerinde kendiliğinden ortaya çıkabileceğini göstermiştir. Birden fazla araştırmacının sonraki çalışmaları, hipokampus8,9,10'un ağ durumunu düzenlemede nöromodülatörlerin rolü ve daha önce in vivo11'deki davranış sırasında aktif olan nöronal toplulukların in vitro yeniden aktasyonlarını yönlendiren sinaptik mekanizmalar da dahil olmak üzere SWR'lerin birçok yönünü yavaş yavaş aydınlattı. Beyin dilimi deneyleri ayrıca gama aralığı salınımı (30-100 Hz), bellek kodlamasını desteklediğine ve12 , 13'ü geri çağırdığına inanılan ayrı bir hipokampal ağ durumu hakkında fikir sağlamıştır. Son olarak, hipokampüsün ve ilişkili yapıların temporal lob epilepsisinin patofizyolojisyolojislerindeki merkezi rolünü kabul eden14,15, araştırmacılar epileptiform aktivitenin neslini ve yayılmasını araştırmak için hipokampal dilim preparatlarını kullanmıştır. Carter ve arkadaşları, kronik epileptik hayvanlardan hazırlanan kombine hipokampal-entorhinal korteks dilimlerinin kendiliğinden in vitro16'daepileptikform akıntılar oluşturabileceğini göstermiştir. Daha sonra Karlócai ve arkadaşları, hipokampal dilimlerde epileptiform deşarjların altında yatan mekanizmaları, değiştirilmiş iyon konsantrasyonlarına sahip modifiye yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (mg2+ veya yükseltilmiş K+azaltılmış) veya eklenen ilaçlar (4AP veya gabazin)17kullanarak araştırdı.
Araştırmacılar anahtar şekillerde farklılık gösteren çok sayıda hipokampal dilim yaklaşımı geliştirmiştir: (1) dilimde bulunan hipokampüsün bölgesi (dorsal, orta veya ventral); (2) entorhinal korteks gibi ekstrahippocampal dokuların varlığı veya yokluğu; (3) dilimleri kesmek için kullanılan yönlendirme (koronal, sagittal, yatay veya eğik); ve (4) dilimlemeden sonra dokunun tutulduğu koşullar (ACSF'ye tamamen batırılmış veya ACSF ve nemlendirilmiş, karbojen bakımından zengin hava arayüzünde tutulur).
Hangi dilimleme yaklaşımının kullanılacağı deneysel amaç tarafından belirlenmelidir. Örneğin, sualtı koşullarında tutulan dorsal hipokampüsün enine veya koronal dilimleri intrahippocampal devre ve sinaptik plastisitenin araştırılması için çok etkili bir şekilde kullanılmıştır18,19,20. Bununla birlikte, bu tür preparatlar kendiliğinden ventral hipokampus 21,22,23'tendilimler kadar kolay ağ salınımları oluşturmaz. Kalıcı SWR aktivitesi durumu dorsal ve ventral hipokampus24'tenenine dilimlerde tetanik stimülasyon ile indüklenebilir, spontan SWR'ler ventral dilimlerde daha kolay gözlenir7,25.
Dorsal ve ventral hipokampus arasındaki doğal fizyolojik ve anatomik ayrım, hem in vivo hem de in vitro26yapılan çalışmalarla desteklenmektedir. Sıçanlardaki kayıtlar, sırt ve ara hipokampus boyunca güçlü bir şekilde tutarlı teta ritimleri ortaya çıkardı, ancak ventral bölge ile hipokampüsün geri kalanı arasında zayıf tutarlılık27. Vivo'daki SWR'ler sırt ve ara hipokampus arasında kolayca yayılırken, ventral hipokampustan kaynaklanan SWR'ler genellikle yerel kalır28. Sırt ve ara hipokampusta bulunan CA3 piramidal nöronlardan kaynaklanan ilişkisel projeksiyonlar, hipokampüsün boyuna ekseni boyunca uzun mesafeler yansıtır. Ventral bölgelerden kaynaklanan CA3 projeksiyonları nispeten yerel kalır ve bu nedenle dilimleme işlemi sırasında kopma olasılığı daha düşüktür29,30. Bu nedenle ventral dilimler, popülasyon senkron oluşturmak için gerekli yinelenen ağı daha iyi koruyabilir. Ventral dilimlerin in vitro spontan ağ aktiviteleri üretme eğilimi, daha dorsal bölgelere kıyasla piramidal nöronların daha yüksek içsel uyarılmazlığını veya ventral hipokampusta daha zayıf GABAerjik inhibisyonu yansıtabilir31. Gerçekten de, ventral hipokampal dilimler epileptiform aktiviteye daha duyarlıdır32,33. Bu nedenle, spontan fizyolojik8,9,11,24 veya patolojik16,34,35,36 ağ salınımlarının birçok çalışması geleneksel olarak yatay bir dilimleme yaklaşımı kullanmıştır, bazen fronto-oksipital yönde hafif bir açı ile, ventral hipokampus enine düzlemine paralel doku dilimleri verir.
Dilimdeki birçok hücre kesileceği için ağ bağlantısı, dilimleme yordamı tarafından kaçınılmaz olarak etkileniyor. Dilim ve hazırlıkta tutulan dokunun açısı ve kalınlığı, ilgi çekici devrelerdeki bağlantıyı optimize etmek için düşünülmelidir. Birçok çalışma, fizyolojik veya patolojik ağ salınımları bağlamında iki yapı arasındaki etkileşimleri araştırmak için yatay kombine hipokampal-entorhinal korteks dilimlerini (HEC) kullanmıştır. Roth ve arkadaşları, SWR aktivitesinin HEC dilimi37aracılığıyla yayılmasını göstermek için hipokampüsün CA1 alt alanı ve medial entorhinal korteksin V katmanından çift kayıt gerçekleştirdi. Epileptiform aktivitenin birçok çalışması, epileptiform deşarjların corticohippocampal ağ 16,35 ,36,38üzerinden nasıl yayıldığını araştırmak için HEC dilim hazırlığını kullanmıştır. Bozulmamış corticohippocampal döngünün korunmasının spontan SWR'ler, epileptikform deşarjlar veya gama salınımları için bir ön koşul olmadığını belirtmek önemlidir; ağ salınımları, dorsal veya ventral hipokampüsün enine dilimlerinde, bağlı parahippocampal dokular21 , 22 , 23,25,39, 40,41ile üretilebilir. Hipokampal dilimlerdeki ağ salınımlarının spontan üretimi için daha önemli bir faktör, daha kalın bir dilim (400-550 μm) CA2 / CA3 tekrarlayan ağ21, 22 ,25'te daha fazla bağlantıyıkoruyacağından,her dilimin kalınlığı olabilir.
Açılı yatay HEC dilimleri (fronto-oksipital yönde yaklaşık 12 ° açı ile kesilmiş) corticohippocampal döngü11, 16,34,35,42fonksiyonel bağlantısını incelemek için kullanılmış olsa da, bu tür açılı preparatlar spontan ağ aktivitesi için gerekli değildir43,44,45. Bununla birlikte, açılı bir dilimleme düzleminin kullanılması, araştırmacının aşağı veya yukarı doğru bir açı uygulanıp uygulanmadığına bağlı olarak, ventral veya ara hipokampüsün enine yönelimli lamelini en iyi şekilde koruyan dilimleri seçici olarak yapmasına izin verir (Şekil 1). Bu yaklaşım kavramsal olarak papatheodoropoulos ve ark., 2002 tarafından kullanılan benzerdir, kim her hipokampus ücretsiz parçaladı ve daha sonra tüm dorsal-ventral eksen boyunca enine dilimler oluşturmak için bir doku helikopteri kullandı21. Ventral ve dorsal-ara hipokampus arasındaki yukarıda belirtilen fonksiyonel ayrımlar ışığında, araştırmacılar deneyler tasarlarken veya sonuçları yorumlarken dilimlerin anatomik kökenini göz önünde bulundurmalıdır. Dilimleme işlemi sırasında bir agar rampası kullanmak, tercihen ara veya ventral hipokampustan dilimler üretmenin basit bir yoludur.
Hipokampal dilimler, batık bir bölmede (doku tamamen ACSF'ye batırılmış olarak) veya arayüz tarzı bir odada (örneğin, Oslo veya Haas odası, dilimler yalnızca ince bir akan ortam filmiyle kaplanmış olarak) muhafaza edilebilir. Arayüz bakımı, nöronal sağkalımını destekleyen ve yüksek düzeyde internöral aktiviteye izin veren dokunun oksijenlenmesini arttırır. Geleneksel olarak, batık kayıt koşulları, ağ düzeyinde salınımların istikrarlı bir şekilde ifade edilmesi için yeterli doku oksijenasyonu sağlamayan daha yavaş bir ACSF akış hızı kullanır. Batık hipokampal dilimlerde karbachol kaynaklı gama salınımları sadece geçici olarak46,47, gözlenirken, arayüz kayıt odalarında10, 48,49' da sıkıca tutulabilirler. Bu nedenle, karmaşık spontan aktivite in vitro ile ilgili birçok çalışma, keskin dalga dalgalanma kompleksleri 6 ,7, 8,9,10,25,37, gama salınımları 10 , 13 ve epileptiform aktivite16,38,45,47'yi araştırmak için arayüz kayıt odalarına güvendi.
Batık tarzdaki bir kayıt odasında, tek tek hücreleri görselleştirmek ve kayıtlar için sağlıklı görünen hücreleri seçici olarak hedeflemek için daldırma mikroskobu hedefi kullanılabilir. Batık preparat ayrıca hücresel milieu üzerinde ince kontrol sağlar, çünkü dalgıçlık ilaçların veya diğer bileşiklerin dokuya hızlı bir şekilde difüzyonunu kolaylaştırır. Bu nedenle, kararlı ağ salınımlarının batık koşullar altında sürdürüldüğü değiştirilmiş bir metodoloji güçlü bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Bu yaklaşım, hipokampal dilimlerin dokuya oksijen beslemesini artırmak için yüksek acsf (~ 6 mL / dk) akış hızına sahip değiştirilmiş bir sualtı kayıt odasına transfer etmeden önce birkaç saat boyunca basitleştirilmiş bir arayüz tarzı tutma odasında iyileştiği Hájosveark.'ınçalışmasıyla örneklenmiştir. Bu koşullar altında, yüksek düzeyde internöron aktivitesi ve kararlı spontan ağ salınımları su altında bir kayıt odasında tutulabilir. Bu değiştirilmiş yaklaşım, araştırmacıların görsel olarak yönlendirilmiş tam hücre yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmelerini ve morfolojik olarak tanımlanmış hücre tiplerinin karbachol kaynaklı gama salınımlarına katkısını karakterize etmelerini sağlar12. SWR'ler, ACSF11,48,49hızlı akış hızına sahip batık hipokampal dilimlerde de kendiliğinden oluşabilir. Maier ve arkadaşları, batık bir kayıt odasına transfer edilmeden önce bir arayüz odasında kurtarılan hipokampal dilimlerin güvenilir bir şekilde spontan SWR'ler sergilediğini, oysa batık bir kayıt odasına transfer edilmeden önce bir behere batırılmış olarak kurtarılan dilimlerin daha küçük uyarılmış alan tepkileri, daha düşük spontan sinaptik akım seviyeleri gösterdiğini ve sadece çok nadiren spontanSWR'lersergilediğini göstermiştir 43 . Schlingloff ve arkadaşları, parvalbumin ifade eden sepet hücrelerinin spontan SWR44'ünneslindeki rolünü göstermek için bu geliştirilmiş metodolojiyi kullandı.
Aşağıdaki protokol, yatay hipokampal dilimlerdeki kendiliğinden aktif nöronların arayüz koşullarında kurtarılabileceği ve daha sonra farmakolojik veya optogenetik manipülasyonlar ve görsel olarak yönlendirilmiş kayıtlar için uygun bir su altında kayıt odasında tutulabileceği bir dilimleme yöntemi ssunuyor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

Akut kemirgen beyin dilimlemesi, elektrofizyoloji, mikroskopi ve farmakoloji kullanarak tek hücreli çözünürlükle sinir devrelerinin organizasyonu ve işlevi hakkında fikir edinmek için çekişli deneysel bir yaklaşım sunar. Bununla birlikte, in vitro deneylerin tasarımında önemli bir husus, farklı dilim preparatlarının in vivo olarak gözlemlendiği gibi doğal sinirsel aktivite kalıplarını ne ölçüde yeniden özetlediğidir. Sağlam beyinde, hipokampal ağ, uyanık tüketici durumlar veya REM olmayan uyku sırasında meydana gelen keskin dalga dalgalanma komplekslerinin (SWR' ler) örneklediği gibi, hayvanın davranışsal durumunu yansıtan yüksek oranda senkronize popülasyon aktivitesi oluşturur. SWR'ler ve diğer ağ aktivitesi biçimleri, uygun koşullar altında izole hipokampal dilimlerde kendiliğinden ortaya çıkabilir. Hipokampal ağ aktivitesinin araştırılmasına güçlü beyin dilimi araç setini uygulamak için, doku sağlığını ve hipokampal ağ içindeki fonksiyonel bağlantının korunmasını optimize eden bir yaklaşım kullanmak gerekir. Fareler transkardiyal olarak soğuk sakkaroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısı ile perfüzyona edilir. Hipokampus içeren yatay dilimler, sinaptik bağlantıyı korumak için 450 μm kalınlığında kesilir. Dilimler arabirim stili bir bölmede kurtarılır ve kayıtlar için batık bir odaya aktarılır. Kayıt odası, dilimin oksijenlenmesini iyileştirmek için yapay beyin omurilik sıvısının yüksek akış hızında çift yüzeyli süperfüzyonu için tasarlanmıştır. Bu protokol, karmaşık ve spontan ağ aktivitesinin in vitro araştırılmasına uygun sağlıklı doku sağlar.

Burada, bu protokolde açıklandığı gibi hazırlanan HEC dilimlerinden temsili kayıtlar sunulmaktadır. Bir arayüz tutma odasında kurtarmadan sonra (Şekil 1C), dilimler tek tek su altında bir kayıt odasına aktarılır (Şekil 2B). Kayıt odası, peristaltik bir pompa kullanılarak karbojen doymuş ACSF ile birlikte verilir (Şekil 2A). Pompa ilk olarak ACSF'yi bir tutma kabından ısıtılmış bir hazneye çeker. Karbojen...

Watch this Scientific Journal Video about Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity at JoVE.com

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Bu protokol, spontan keskin dalga dalgalanma aktivitesi sergileyen farelerden yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanmasını açıklar. Dilimler basitleştirilmiş bir arayüz tutma odasında inkübe edilir ve kayıtlar, doku oksijenlenmesini ve ağ düzeyinde aktivitenin kendiliğinden ortaya çıkmasını teşvik etmek için hızlı akan yapay beyin omurilik sıvısı ile su altında koşullar altında gerçekleştirilir.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Using this protocol, researchers can investigate the mechanisms underlying hippocampal network oscillations in acute mouse brain slice preparations. In this preparation, recordings are performed under submerged conditions in slices generating spontaneous network oscillations, allowing pharmacological and optogenetic techniques to be performed, and single-cell recordings to be visualized. For transcardial perfusion, immediately before removing the mouse from the isoflurane chamber, fill a Petri dish lid with three to five millimeters of chilled sucrose solution, and fill the Petri dish bottom with approximately one centimeter of chilled sucrose solution.Quickly transfer the anesthetized mouse to the left absorbent pad, and use three pieces of tape to secure the forelimbs and tail. Using large tissue forceps and surgical scissors, tent the skin and make a lengthwise incision from the bottom of the sternum to the top of the chest. Use the forceps to pull up on the sternum and use the scissors to cut through the diaphragm.Use the scissors to cut through the rib cage on each side in one large motion toward the point at which the forelimb meets the body, and use the forceps to position the front of the rib cage toward the head. Use the scissors to make a horizontal cut to completely remove the ribs, and use the forceps to hold the heart in place while inserting a 20-gauge perfusion needle into the left ventricle. When the needle is in place, use small dissection scissors to make an incision in the right atrium, and allow the blood to be flushed out of the circulatory system.To extract the brain, after decapitation, use small bond scissors to make two lateral cuts through the skull toward the midline at the front of the skull near the eyes, and make two additional cuts on either side of the base of the skull. Immerse the head in the glass Petri dish, and use the scissors to cut along the midline across the entire length of the skull, while pulling up with the scissors to minimize damage to the underlying brain tissue. Use small tissue forceps to firmly grasp each side of the skull, and to lift the bone up and away from the brain to open the cranium like a book.Using the fingers of the left hand to hold the flaps of the skull open, insert the microspatula under the brain near the olfactory bulbs, and flip the brain out of the skull into the sucrose. Use the microspatula to sever the brainstem, and wash the brain to remove any residual blood, fur, or tissues. Use the large spatula to transfer the brain to the glass Petri dish lid, and use half of a double-edged razor blade to make a coronal cut in the most anterior portion of the brain, including the olfactory bulbs.Next, make a coronal cut to remove the cerebellum, and apply cyanoacrylate adhesive to an agar ramp. Use forceps to briefly dry the brain on a piece of filter paper, before placing the tissue into the adhesive on the agar ramp, ventral-side down. Place the slicing platform into the slicing chamber of a microtome, and completely cover the setup with chilled sucrose solution.Use the large spatula to stir some sucrose slurry into the chamber, melting any frozen sucrose and rapidly bringing down the mixture temperature to one to two degrees Celsius. Cut slices to a thickness of 450 microns at 0.07 millimeters per second slicing speed. As each slice is freed, use the small-tissue forceps and a sharp scalpel to separate the two hemispheres, and to cut away tissue until the slice consists primarily of the hippocampus and perihippocampal regions.Use a plastic transfer pipette to transfer the slices individually to an interface recovery chamber containing warmed aCSF. With the slices positioned at the interface of the aCSF and air, and with only a thin meniscus of aCSF covering the slices. When all of the slices have been acquired, tightly close the chamber to allow the slices to recover at 32 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of the recovery period, place the chamber on a stirrer set to a slow speed to promote aCSF circulation within the chamber. To record local field potentials, fill a 400 milliliter beaker with carbogen-bubbled aCSF, and place one end of the pump tubing into the beaker. Turn on a peristaltic pump at 8 to 10 milliliters per minute to direct aCSF from the 400 milliliter beaker to a heated reservoir, and from the reservoir to the recording chamber at 32 degrees Celsius.Next, briefly clamp the tubing and turn off the pump to pause the flow. Using fine forceps, transfer a brain tissue slice to the recording chamber by the corner of the lens paper the tissue is resting on, slice down. Peel away the lens paper, leaving the slice emerged in the recording chamber, and use a harp to secure the slice.Using a manual micromanipulator, slowly advance the tip of a sodium chloride-filled stimulation pipette into the surface of the slice at a 30 to 45 degree angle, then use a second micromanipulator to slowly advance the tip of an aCSf-filled local field potential pipette into the region of interest at a 30 to 45 degree angle, and record the local field potential of the sample according to standard protocols. In this figure, representative recordings from hippocampal entorhinal cortex slices, prepared according to the protocol as demonstrated, can be observed. In healthy slices, electrical stimulation should produce a field post-synaptic potential with a small pre-synaptic fiber volley and a large post-synaptic potential with a rapid initial descent.Spontaneous sharp-wave ripples should also be visible as positive deflections in the local field potential in the stratum pyramidale. In suboptimal slices, evoked field post-synaptic potentials demonstrate a large fiber volley, and a relatively small post-synaptic potential, and such slices do not exhibit spontaneous sharp-wave ripples. In vitro sharp-wave ripples demonstrate a positive field potential in the stratum pyramidale layer, with an overlaid high-frequency oscillation paired with a negative field potential in the stratum radiatum layer.As illustrated, sharp-wave ripples in hippocampal entorhinal cortex slices originate within CA2/CA3 recurrent circuits, and propagate to CA1. It is essential to bubble carbogen into the solutions throughout the procedure, to ensure that the sucrose solution is chilled, and to perform each step as quickly as possible. After preparing these slices, extracellular or intracellular recordings can be performed, along with optogenetic or pharmacological experiments to determine how different cell types contribute to the function of neural networks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

Varsayılan Modu Ağ inceleyin Transkraniyal Manyetik Uyarım ve fMRI birleştiren

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Olarak spontan lokomotor aktivitenin belirlenmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Fizyolojik Sıcaklık Akut Yetişkin Beyin Dilimleme

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için<em&gt; İn Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

Sıçanlarda Akut İnme Sonrası Beyin İyileşmesini Değerlendiren Bir Preklinik Model

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Elektrofizyolojik Kayıtlar için Akut İnsan Hipokampal Dilimlerinin Hazırlanması

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...