Name: combining multiplex fluorescence in situ hybridization with fluorescent immunohistochemistry on fresh frozen or fixed mouse brain sections
Uploaded: 2021-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch das Australian Research Council Discovery Project Grant DP180101890 und das Rebecca L Cooper Medical Research Foundation Project Grant PG2018110 finanziert

Eine Zusammenfassung der Schritte zur Gewebevorverarbeitung ist in Abbildung 1 zu finden. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Animal Care and Ethics Committee der University of New South Wales in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (Australian National Health and Medical Research Council) durchgeführt.
1. Probenvorbereitung von frischem, gefrorenem Hirngewebe
<ol><li>Transkar...

<ol>
	<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Annese, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+dual+ISH-IHC+technology+to+study+angiogenesis+in+diffuse+large+B-cell+lymphomas.">RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas.</a> Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).</li><li>Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+in+vivo+gene+expression+during+collective+cell+migration+using+an+integrated+RNAscope,+immunohistochemistry+and+tissue+clearing+method.">Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method.</a> Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, 55 (2014).</li><li>Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+and+cell-specific+confirmation+of+RNA+and+protein+in+the+mouse+retina.">Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).</li><li>Kersigo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RNAscope+whole+mount+approach+that+can+be+combined+with+immunofluorescence+to+quantify+differential+distribution+of+mRNA.">A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA.</a> Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).</li><li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures.">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).</li><li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization.">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).</li><li>Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+and+immunofluorescence+imaging+for+detection+of+cytokine+expression+in+microglia/macrophage+cells.">Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells.</a> Bio-Protocol. 7 (22), (2017).</li><li>Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+respiratory-related+brain+regions+to+long-term+hypercapnia:+focus+on+neuropeptides+in+the+RTN.">Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).</li><li>Lazarenko, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensitivity+and+ultrastructure+of+the+retrotrapezoid+nucleus+in+Phox2b-EGFP+transgenic+mice.">Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).</li><li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections.">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).</li><li>Kerr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+knock-in+mice+expressing+fluorescently+tagged+galanin+receptors+1+and+2.">The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).</li><li>Kachidian, P., Pickel, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+tyrosine+hydroxylase+in+neuronal+targets+and+efferents+of+the+area+postrema+in+the+nucleus+tractus+solitarii+of+the+rat.">Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).</li><li>Stornetta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Phox2b+by+brainstem+neurons+involved+in+chemosensory+integration+in+the+adult+rat.">Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat.</a> Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).</li><li>Gilmor, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+putative+vesicular+acetylcholine+transporter+in+rat+brain+and+localization+in+cholinergic+synaptic+vesicles.">Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).</li><li>Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+neuropeptides+derived+from+a+common+precursor+are+differentially+packaged+and+transported.">Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported.</a> Cell. 54 (6), 813-822 (1988).</li><li>Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+tyrosine-hydroxylase+immunocytochemistry+in+paraffin+sections+using+pretreatment+with+proteolytic-enzymes.">Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).</li><li>Biancardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+excitatory,+inhibitory,+and+modulatory+afferent+projections+to+the+anatomically+defined+active+expiratory+oscillator+in+adult+male+rats.">Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).</li><li>Matthews, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+in+the+brainstem:+an+excitatory+disynaptic+pathway+for+control+of+whisking.">Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections.">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).</li><li>Yamashita, S., Katsumata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval+in+immunohistochemistry:+mechanisms+and+applications.">Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).</li><li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval:+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry.">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li></ol>

In den Neurowissenschaften werden FISH und IHC routinemäßig eingesetzt, um die räumliche Organisation und funktionelle Bedeutung von mRNA oder Proteinen innerhalb neuronaler Subpopulationen zu untersuchen. Das in dieser Studie beschriebene Protokoll verbessert die Fähigkeit zum gleichzeitigen Nachweis von mRNAs und Proteinen in Hirnschnitten. Unser kombinierter Multiplex-FISH-IHC-Assay ermöglichte die phänotypische Identifizierung verschiedener neuronaler Subpopulationen im NTS sowohl in frisch gefrorenen als auch ...

Proteine und mRNAs, die neurochemisch Subpopulationen von Neuronen definieren, werden üblicherweise mit einer Kombination aus Immunhistochemie (IHC) und/oder In-situ-Hybridisierung (ISH) identifiziert. Die Kombination von ISH mit IHC-Techniken erleichtert die Charakterisierung von Kolokalisationsmustern, die für funktionelle Neuronen einzigartig sind (neurochemische Kodierung), indem die Multiplex-Markierungskapazität maximiert wird.
Fluoreszierende ISH (FISH)-Methoden, einschließlich RNAscope, haben eine höhere Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu früheren RNA-Nachweismethoden wie radioaktivem ISH und nicht-radioaktivem chromogenem ISH. FISH ermöglicht die Visualisierung einzelner mRNA-Transkripte als punktgefärbte Spots1. Darüber hinaus ermöglicht der RNAscope-Assay die gleichzeitige Markierung einer größeren Anzahl von RNA-Zielen unter Verwendung verschiedener Fluorophor-Tags. Trotz dieser Vorteile können technische Einschränkungen die Anzahl der Fluorophore/Chromogene beeinflussen, die in einem einzigen Experiment verwendet werden können. Dazu gehören die Verfügbarkeit von Mikroskop-Filtersets; Solche Überlegungen werden noch verstärkt, wenn die neurochemische Identifizierung kombinierte FISH und IHC verwendet, verglichen mit der Verwendung beider Techniken allein, da inhärente Schritte, die für eine Methode optimal sind, für die andere nachteilig sein können.
Frühere Anwendungen von FISH in Kombination mit IHC haben die Expression spezifischer zellulärer Ziele in humanen B-Zell-Lymphomen2, Kükenembryonen3, Zebrafischembryonen4, Maus-Retina5 und Maus-Innenohrzellen6 gezeigt. In diesen Studien wurde das Gewebepräparat entweder in formalinfixiertes Paraffin eingebettet (FFPE)2,3,5 oder in frisches ganzesMount-4,6 eingelassen. In anderen Studien wurde chromogenes RNAscope auf fixierte Gehirnpräparate von Mäusen und Ratten angewendet 7,8,9. Insbesondere Baleriola et al.8 beschrieb zwei verschiedene Gewebepräparate für die kombinierte ISH-IHC; Korrigierte Maus-Gehirn-Schnitte und FFPE-Sektionen des menschlichen Gehirns. In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung haben wir FISH und fluoreszierende IHC auf frischen Gefrierschnitten kombiniert, um gleichzeitig mRNA mit geringer Häufigkeit (Galaninrezeptor 1, GalR1), mRNA mit hoher Häufigkeit (Glycintransporter 2, GlyT2) und vesikuläres Acetylcholintransporter (vAChT)-Protein10 in der retikulären Formation des Hirnstamms sichtbar zu machen.
Der Kern des Solitärtrakts (NTS) ist eine wichtige Hirnregion, die an der autonomen Funktion beteiligt ist. Diese heterogene Population von Neuronen befindet sich im Hinterhirn und empfängt und integriert eine große Anzahl autonomer Signale, einschließlich solcher, die die Atmung regulieren. Das NTS beherbergt mehrere neuronale Populationen, die phänotypisch durch das Expressionsmuster von mRNA-Zielen wie GalR1 und GlyT2 sowie Proteinmarker für das Enzym Tyrosinhydroxylase (TH) und den Transkriptionsfaktor Paired-like homeobox 2b (Phox2b) charakterisiert werden können.
Der RNAscope-Inhaber empfiehlt frische, gefrorene Gewebepräparate, aber Gewebe, das durch transkardiale Perfusionsfixierung bei Ganztieren hergestellt wurde, zusammen mit langfristiger Kryoprotektion (Lagerung bei -20 °C) von fixierten gefrorenen Gewebeschnitten, ist in vielen Labors üblich. Daher haben wir versucht, Protokolle für FISH in Kombination mit IHC unter Verwendung von frisch gefrorenen und fixierten gefrorenen Gewebepräparaten zu erstellen. Hier stellen wir für frisch gefrorene und fixierte gefrorene Hirnschnitte zur Verfügung: (1) ein Protokoll für kombinierte FISH und fluoreszierende IHC, (2) eine Beschreibung der Qualität der mRNA- und Proteinmarkierung, die bei Verwendung jedes Präparats erzeugt wird, (3) eine Beschreibung der Expression von GalR1 und GlyT2 im NTS.
Unsere Studie zeigte, dass in Kombination mit der RNAscope-Methodik der IHC-Erfolg in frisch gefrorenen und fixierten gefrorenen Präparaten variierte und von der Lokalisierung der Zielproteine in der Zelle abhing. In unseren Händen war die Markierung membrangebundener Proteine immer erfolgreich. Im Gegensatz dazu erforderte die IHC für zytoplasmatische Proteine eine Fehlerbehebung auch in Fällen, in denen das zytoplasmatische Protein in einem transgenen Tier überexprimiert wurde (Phox2b-GFP)11. Während GalR1 im NTS in nicht-katecholaminergen Neuronen exprimiert wird, fehlt die GlyT2-Expression im NTS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
			<td>Australian BioResources, Moss Vale</td>
			<td>MGI: 2159769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phox2b-eGFP mouse</td>
			<td>Australian BioResources, Moss Vale</td>
			<td>MGI: 5776545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Sodium</td>
			<td>Clifford Hallam Healthcare</td>
			<td>1070760</td>
			<td>Consult local veterinary supplier or pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade agarose powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, 118mL</td>
			<td>Scigen Ltd</td>
			<td>4586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, prilled, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000&#160; (PVP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>With or without DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)</td>
			<td>ADV320850</td>
			<td>Includes 50x Wash buffer and Protease III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop incubator</td>
			<td>Thermoline scientific micro incubator</td>
			<td>Model: TEI-13G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drawing-up needle (23 inch gauge)</td>
			<td>BD</td>
			<td>0288U07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimberley Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Coleparmer Masterflex</td>
			<td>L/S Series&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 2000R Digital Camera</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>RET-2000R-F-CLR</td>
			<td>colour camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Glass Slides (White)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome (Vibratome)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA1001110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CorelDRAW&#160;</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td>Version 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (ImageJ Distribution)</td>
			<td>Open Source/GNU General Public Licence (GPL)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. &#38; Hiner, M. C. et al. (2017), &#34;ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data&#34;, BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z&#160;&#160; and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. &#38; Frise, E. et al. (2012), &#34;Fiji: an open-source platform for biological-image analysis&#34;, Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMARY ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB1542</td>
			<td>Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB318</td>
			<td>Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ABN100</td>
			<td>Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-308</td>
			<td>Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phox2b Antibody (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SECONDARY ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>713-155-147</td>
			<td>Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td>Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>713-175-147</td>
			<td>Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNASCOPE PROBES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe</td>
			<td>ACDBio</td>
			<td>448821-C1</td>
			<td>targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine transporter 2 oligonucleotide probe</td>
			<td>ACDBio</td>
			<td>409741-C3</td>
			<td>targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phox2b oligonucleotide probe</td>
			<td>ACDBio</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td>targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining multiplex fluorescence in situ hybridization with fluorescent immunohistochemistry on fresh frozen or fixed mouse brain sections

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine molekulare Technik, die das Vorhandensein und die räumliche Verteilung spezifischer RNA-Transkripte in Zellen identifiziert. Die neurochemische Phänotypisierung von funktionell identifizierten Neuronen erfordert in der Regel die gleichzeitige Markierung mit mehreren Antikörpern (Targeting-Protein) mittels Immunhistochemie (IHC) und die Optimierung der In-situ-Hybridisierung (Targeting-RNA ). Eine "neurochemische Signatur" zur Charakterisierung bestimmter Neuronen kann erreicht werden, aber zu den erschwerenden Faktoren gehören die Notwendigkeit, FISH- und IHC-Ziele vor der Kombination der Methoden zu verifizieren, und die begrenzte Anzahl von RNAs und Proteinen, die gleichzeitig innerhalb desselben Gewebeschnitts anvisiert werden können.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das sowohl frisch gefrorene als auch fixierte Mäusegehirnpräparate verwendet, das mehrere mRNAs und Proteine im selben Gehirnschnitt mit RNAscope FISH und anschließender Fluoreszenz-Immunfärbung nachweist. Wir verwenden die kombinierte Methode, um das Expressionsmuster von mRNAs mit geringer Häufigkeit (z. B. Galaninrezeptor 1) und mRNAs mit hoher Häufigkeit (z. B. Glycintransporter 2) in immunhistochemisch identifizierten Hirnstammkernen zu beschreiben.
Die wichtigsten Überlegungen für die Proteinmarkierung nach dem FISH-Assay gehen über die Gewebevorbereitung und die Optimierung der FISH-Sondenmarkierung hinaus. Zum Beispiel haben wir herausgefunden, dass die Antikörperbindung und die Markierungsspezifität durch den Proteaseschritt innerhalb des FISH-Sonden-Assays nachteilig beeinflusst werden können. Proteasen katalysieren die hydrolytische Spaltung von Peptidbindungen und erleichtern so den Eintritt der FISH-Sonde in die Zellen, aber sie können auch das Protein verdauen, auf das der nachfolgende IHC-Assay abzielt, wodurch eine Off-Target-Bindung entsteht. Die subzelluläre Lokalisation des Zielproteins ist ein weiterer Faktor, der zum Erfolg der IHC nach dem FISH-Sondentest beiträgt. Wir beobachteten, dass die IHC-Spezifität erhalten blieb, wenn das Zielprotein membrangebunden ist, während IHC, das auf das zytoplasmatische Protein abzielte, eine umfangreiche Fehlerbehebung erforderte. Schließlich stellten wir fest, dass die Handhabung von fixiertem gefrorenem Gewebe auf Objektträgern schwieriger war als die von frischem gefrorenem Gewebe, jedoch war die IHC-Qualität mit fixiertem gefrorenem Gewebe in Kombination mit RNAscope insgesamt besser.

In dieser Arbeit skizzieren wir eine Methode zur Kombination von Multiplex-FISH mit fluoreszierender IHC, um die mRNA-Expression für GalR1 und GlyT2 unter Verwendung von frisch gefrorenem bzw. paraformaldehydfixiertem Gewebe im NTS der Maus zu lokalisieren. Eine Pipeline der in den Methoden beschriebenen Gewebeverarbeitungs-, FISH- und IHC-Verfahren ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung der in j...

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Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Dieses Protokoll kombiniert Fluoreszenz-RNAscope-In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie unter Verwendung von frisch gefrorenen oder fixierten Gehirnpräparaten. Diese Technik ermöglicht Flexibilität durch die Demonstration einer Kombination aus hochempfindlicher In-situ-Hybridisierung und immunhistochemischen Methoden zur räumlichen Visualisierung von RNA- und Proteinzielen in derselben Gewebeprobe. Diese Methode ist für die Multiplex-Markierung in Hirngewebeschnitten anwendbar und hilft bei der Untersuchung der räumlichen Organisation und funktionellen Bedeutung von mRNA und Proteinen innerhalb heterogener neuronaler Populationen in den Neurowissenschaften.Dieses Protokoll konzentriert sich hauptsächlich auf Verarbeitungsschritte für frisch gefrorenes Gewebe und paraformaldehydfixiertes Gewebe. Um mit dem Schneiden des frisch gefrorenen Hirngewebes zu beginnen, befestigen Sie es auf dem vorgekühlten Kryostat-Chuck und schneiden Sie 14 Mikrometer dicke koronale Abschnitte. Montieren Sie die Sektion auf einem Objektträger aus geladenem Glas.Übertragen Sie das montierte Dia in eine Diabox. Anschließend wird die Box auf Trockeneis in den Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius transportiert. Zur Gewebefixierung filtrieren Sie die vorbereitete Paraformaldehydlösung.Auf 4 Grad Celsius abkühlen lassen. Bringen Sie den montierten Objektträger aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius auf Trockeneis und tauchen Sie ihn sofort für 15 Minuten in die vorgekühlte Paraformaldehydlösung. Führen Sie eine Dehydrierung des frisch gefrorenen Gewebes durch, um sicherzustellen, dass der Objektträger vollständig trocken ist. Nachdem das Gehirn mit einem vibrierenden Mikrotom aus einer fixierten transkardialen Profusionshalterung entnommen wurde, wurden 30 Mikrometer dicke Gewebeschnitte geschnitten.Bewahren Sie die geschnittenen Abschnitte in Kryoschutzlösung auf. Am Tag des FISH-Assays wird der frei schwebende Abschnitt in eine 12-Well-Zellkulturplatte mit 0,1 molaren PBS überführt und mit 90 bis 100 U/min auf einem rotierenden Plattformschüttler gerührt, um das Kryoprotektivum abzuwaschen. Befestigen Sie den Abschnitt dann mit einem Pinsel flach auf einem Objektträger für die Glasmikroskopie, um ein Ablösen beim Waschen zu verhindern, und lassen Sie ihn mindestens zwei Stunden lang an der Luft trocknen.Ziehen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine hydrophobe Barriere um den Abschnitt, um die FISH-Reagenzien aufzunehmen. Nach der Vorverarbeitung wird das Gewebe in Proteaselösung inkubiert und gemäß den Richtlinien des Herstellers zwei Stunden lang mit RNAscope-Sonden hybridisiert. Dann werden sequentielle Amplifikationsschritte und Fluoreszenz-Immunhistochemie durchgeführt.Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer befeuchteten, lichtgeschützten Kammer für die Inkubation von Objektträgern. Im Wasserbad 50X Waschpuffer erwärmen und 10 Minuten lang auf 40 Grad Celsius erhitzen. Sobald es auf Raumtemperatur abgekühlt ist, bereiten Sie einen Liter 1-fachen Waschpuffer aus der 50-fachen Stammkonzentration vor.Bereiten Sie die Sondenmischung wie im Textmanuskript beschrieben vor. Für die Proteinase-Behandlung geben Sie Proteinase 3 in den Gewebeschnitt und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Proteinase abzuwaschen, tauchen Sie den Objektträger vorsichtig in 0,1 molar PBS bei Raumtemperatur ein, um zu vermeiden, dass sich der Abschnitt löst.Für die Hybridisierung wird die Sondenmischung in den Gewebeschnitt gegeben. Stellen Sie es in die befeuchtete, vorgewärmte Kammer. Anschließend zwei Stunden bei 40 Grad Celsius inkubieren.Spülen Sie den Gewebeschnitt zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer aus. Zur Signalverstärkung mit einer Tropfflasche eine Amplifikationslösung hinzufügen, um den Gewebeabschnitt abzudecken, und wie im Text beschrieben inkubieren. Geben Sie die Blockierungslösung auf den Gewebeschnitt und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.Schnippen Sie den Objektträger, um den überschüssigen Blockierungspuffer nach der Inkubation zu entfernen. Inkubieren Sie nun den Abschnitt mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie den Objektträger am nächsten Tag dreimal mit 1X TBS.Fügen Sie den sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Abschnitte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Untersuchen Sie den Objektträger unter einem Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist. Erfassen Sie repräsentative Bilder mit 20-facher Vergrößerung und speichern Sie sie als TIF-Dateien.In der vorliegenden Studie wurden die Gewebequalität, die Integrität und die Abwesenheit von bakterieller Kontamination durch das Fehlen einer DAPI-Markierung bestätigt. Die Markierung von Positivkontrollsonden, die auf Ubiquitin C, Peptidylprolylisomerase B und RNA-Polymerase IIA mRNA abzielen, bestätigte die RNA-Integrität. In frisch gefrorenen Präparaten zur Unterscheidung von GalR1-mRNA-positiven Neuronen innerhalb des NTS wurden zusätzliche neurochemische Marker verwendet.Der membrangebundene vesikuläre Transporter war eindeutig markiert. Im Gegensatz dazu wurden zytoplasmatische Proteine wie Tyrosinhydroxylase und GFP, die unter der Kontrolle des PHOX2B-Promotors exprimiert wurden, schwach beobachtet und als flockig beschrieben, da ihnen eine klare Kontur fehlt. Die GalR1 FISH-Sondenmarkierung der zytoplasmatischen GalR1-mRNA war punktuell und konnte deutlich beobachtet werden.Um zu bestätigen, dass die Qualität der Immunhistochemie von der subzellulären Lokalisation des Proteins abhängt, wurden verschiedene nukleäre und zytoplasmatische Proteine parallel zu FISH in denselben Gewebeschnitten markiert. Das zytoplasmatische PHOX2B GFP hatte ein flockendes Aussehen. Das nukleäre PHOX2B-Proteinsignal hingegen war eindeutig, was eine qualitativ hochwertigere Immunmarkierung in Kombination mit FISH bestätigte.Bei der Durchführung an fixierten Schnellschnitten in Kombination mit FISH war die Immunhistochemie unabhängig von der subzellulären Lokalisation zuverlässig. GlyT2-mRNA-positive Neuronen befanden sich ventral des NTS und nicht innerhalb des NTS. GlyT2-mRNA-positive und PHOX2B-mRNA-positive Neuronen kolokalisierten nicht.Eine Subpopulation von PHOX2B-mRNA-positiven NTS-Neuronen war Tyrosinhydroxylase-immunreaktiv, und keines enthielt GlyT2-mRNA. RNAscope ermöglicht die Visualisierung und Analyse der RNA-Verteilung mit Einzelmolekülauflösung in Zellen und Geweben. Es ermöglicht die Erforschung neuartiger RNA-Spezies, Krankheitsmechanismen, Genexpressionsmuster, Neuronenvielfalt und zellulärer Interaktionen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Schnelle<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neurone von Frische und Gefrorene Rattenhirngewebe

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...