Name: combining multiplex fluorescence in situ hybridization with fluorescent immunohistochemistry on fresh frozen or fixed mouse brain sections
Uploaded: 2021-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections at JoVE.com

この研究は、オーストラリア研究評議会のディスカバリープロジェクト助成金DP180101890およびレベッカLクーパー医学研究財団プロジェクト助成金PG2018110によって資金提供されました

組織の前処理ステップの概要を 図1に示します。すべての手順は、科学目的での動物の使用とケアに関するガイドライン(オーストラリア国立保健医療研究評議会)に従って、ニューサウスウェールズ大学の動物管理および倫理委員会に準拠して実施されました。
1. 新鮮凍結脳組織の試料作製
<ol><li>経心灌流<ol><li>ヘパリン処理(2500 U/L)0.1 Mリン酸緩衝...

<ol>
	<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Annese, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+dual+ISH-IHC+technology+to+study+angiogenesis+in+diffuse+large+B-cell+lymphomas.">RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas.</a> Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).</li><li>Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+in+vivo+gene+expression+during+collective+cell+migration+using+an+integrated+RNAscope,+immunohistochemistry+and+tissue+clearing+method.">Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method.</a> Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, 55 (2014).</li><li>Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+and+cell-specific+confirmation+of+RNA+and+protein+in+the+mouse+retina.">Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).</li><li>Kersigo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RNAscope+whole+mount+approach+that+can+be+combined+with+immunofluorescence+to+quantify+differential+distribution+of+mRNA.">A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA.</a> Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).</li><li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures.">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).</li><li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization.">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).</li><li>Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+and+immunofluorescence+imaging+for+detection+of+cytokine+expression+in+microglia/macrophage+cells.">Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells.</a> Bio-Protocol. 7 (22), (2017).</li><li>Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+respiratory-related+brain+regions+to+long-term+hypercapnia:+focus+on+neuropeptides+in+the+RTN.">Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).</li><li>Lazarenko, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensitivity+and+ultrastructure+of+the+retrotrapezoid+nucleus+in+Phox2b-EGFP+transgenic+mice.">Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).</li><li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections.">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).</li><li>Kerr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+knock-in+mice+expressing+fluorescently+tagged+galanin+receptors+1+and+2.">The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).</li><li>Kachidian, P., Pickel, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+tyrosine+hydroxylase+in+neuronal+targets+and+efferents+of+the+area+postrema+in+the+nucleus+tractus+solitarii+of+the+rat.">Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).</li><li>Stornetta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Phox2b+by+brainstem+neurons+involved+in+chemosensory+integration+in+the+adult+rat.">Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat.</a> Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).</li><li>Gilmor, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+putative+vesicular+acetylcholine+transporter+in+rat+brain+and+localization+in+cholinergic+synaptic+vesicles.">Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).</li><li>Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+neuropeptides+derived+from+a+common+precursor+are+differentially+packaged+and+transported.">Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported.</a> Cell. 54 (6), 813-822 (1988).</li><li>Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+tyrosine-hydroxylase+immunocytochemistry+in+paraffin+sections+using+pretreatment+with+proteolytic-enzymes.">Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).</li><li>Biancardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+excitatory,+inhibitory,+and+modulatory+afferent+projections+to+the+anatomically+defined+active+expiratory+oscillator+in+adult+male+rats.">Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).</li><li>Matthews, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+in+the+brainstem:+an+excitatory+disynaptic+pathway+for+control+of+whisking.">Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections.">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).</li><li>Yamashita, S., Katsumata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval+in+immunohistochemistry:+mechanisms+and+applications.">Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).</li><li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval:+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry.">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li></ol>

神経科学では、FISHとIHCは、ニューロン亜集団内のmRNAまたはタンパク質の空間的構成と機能的意義を調査するために日常的に使用されています。この研究で記述されているプロトコルは頭脳セクションのmRNAsそして蛋白質の同時検出のための容量を高める。マルチプレックスFISH-IHCアッセイの組み合わせにより、新鮮な凍結脳製剤と固定脳製剤の両方において、NTSの異なるニューロン亜集団の?...

ニューロンの亜集団を神経化学的に定義するタンパク質およびmRNAは、通常、免疫組織化学(IHC)および/または in situ ハイブリダイゼーション(ISH)の組み合わせでそれぞれ同定されます。ISHとIHC技術を組み合わせることで、マルチプレックス標識能力を最大化することにより、機能性ニューロンに特有の共局在パターンの特性評価(神経化学的コーディング)が容易になります。
RNAscopeを含む蛍光ISH(FISH)法は、放射性ISHや非放射性発色性ISHなどの以前のRNA検出法と比較して、より高い感度と特異性を備えています。FISHは、単一のmRNA転写産物を点状染色スポットとして可視化することができます1。さらに、RNAscopeアッセイでは、異なる蛍光色素タグを用いて、一度により多くのRNAターゲットを標識することができます。これらの利点にもかかわらず、技術的な制限により、1回の実験で使用できる蛍光色素/発色剤の数に影響を与える可能性があります。これらには、顕微鏡フィルターセットの可用性が含まれます。神経化学的同定でFISHとIHCを組み合わせて使用する場合、一方の方法に最適な固有のステップが他方の方法に悪影響を与える可能性があるため、各手法を単独で使用する場合と比較して、このような考慮事項は複雑になります。
IHCと組み合わせたFISHの以前の適用では、ヒトB細胞リンパ腫2、ニワトリ胚3、ゼブラフィッシュ胚4、マウス網膜5、およびマウス内耳細胞6で特異的な細胞標的の発現が実証されています。これらの研究では、組織調製はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)2,3,5または新鮮なホールマウント4,6のいずれかでした。他の研究では、固定されたマウスおよびラットの脳調製物に発色RNAスコープを適用しました7,8,9。特に、Baleriola et al.図8には、ISH-IHCを組み合わせた2つの異なる組織調製物が記載されていた。マウスの脳のセクションとFFPEのヒトの脳のセクションを修正しました。最近の論文では、FISHと蛍光IHCを新鮮凍結切片で組み合わせ、脳幹網様体中の低存在量mRNA(ガラニン受容体1、GalR1)、高存在量mRNA(グリシントランスポーター2、GlyT2)、小胞性アセチルコリントランスポーター(vAChT)タンパク質10を同時に可視化しました。
孤立路核(NTS)は、自律神経機能に関与する主要な脳領域です。後脳に位置するこの不均一なニューロン集団は、呼吸を調節するものを含む膨大な数の自律神経信号を受信して統合します。NTSはいくつかのニューロン集団を有しており、GalR1およびGlyT2を含むmRNA標的の発現パターン、および酵素チロシンヒドロキシラーゼ(TH)および転写因子ペア様ホメオボックス2b(Phox2b)のタンパク質マーカーによって表現型的に特徴付けられる可能性がある。
RNAscopeの所有者は、新鮮な凍結組織調製物を推奨していますが、固定凍結組織切片の長期凍結保護(-20°Cでの保存)とともに、全動物経心灌流固定によって調製された組織は、多くの研究室で一般的です。そこで、新鮮凍結および固定凍結組織調製物を用いたIHCと組み合わせたFISHのプロトコールの確立を目指しました。ここでは、新鮮な凍結および固定凍結された脳切片を提供します:(1)FISHと蛍光IHCを組み合わせたプロトコル、(2)各調製物を利用する場合に生成されるmRNAおよびタンパク質標識の品質の説明、(3)NTSにおけるGalR1およびGlyT2の発現の説明。
私たちの研究は、RNAscopeの方法論と組み合わせた場合、IHCの成功は、新鮮な凍結製剤と固定凍結製剤で異なり、細胞内の標的タンパク質の局在に依存することが明らかになりました。私たちの手では、膜結合タンパク質のラベリングは常に成功していました。対照的に、細胞質タンパク質のIHCは、トランスジェニック動物(Phox2b-GFP)で細胞質タンパク質が過剰発現している場合でもトラブルシューティングが必要でした11。最後に、GalR1はNTSの非カテコールアミン作動性ニューロンで発現しているが、GlyT2の発現はNTSでは存在しない。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
			<td>Australian BioResources, Moss Vale</td>
			<td>MGI: 2159769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phox2b-eGFP mouse</td>
			<td>Australian BioResources, Moss Vale</td>
			<td>MGI: 5776545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Sodium</td>
			<td>Clifford Hallam Healthcare</td>
			<td>1070760</td>
			<td>Consult local veterinary supplier or pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade agarose powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, 118mL</td>
			<td>Scigen Ltd</td>
			<td>4586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, prilled, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000&#160; (PVP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>With or without DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)</td>
			<td>ADV320850</td>
			<td>Includes 50x Wash buffer and Protease III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop incubator</td>
			<td>Thermoline scientific micro incubator</td>
			<td>Model: TEI-13G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drawing-up needle (23 inch gauge)</td>
			<td>BD</td>
			<td>0288U07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimberley Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Coleparmer Masterflex</td>
			<td>L/S Series&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 2000R Digital Camera</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>RET-2000R-F-CLR</td>
			<td>colour camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Glass Slides (White)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome (Vibratome)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA1001110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CorelDRAW&#160;</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td>Version 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (ImageJ Distribution)</td>
			<td>Open Source/GNU General Public Licence (GPL)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. &#38; Hiner, M. C. et al. (2017), &#34;ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data&#34;, BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z&#160;&#160; and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. &#38; Frise, E. et al. (2012), &#34;Fiji: an open-source platform for biological-image analysis&#34;, Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMARY ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB1542</td>
			<td>Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB318</td>
			<td>Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ABN100</td>
			<td>Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-308</td>
			<td>Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phox2b Antibody (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SECONDARY ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>713-155-147</td>
			<td>Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td>Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>713-175-147</td>
			<td>Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNASCOPE PROBES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe</td>
			<td>ACDBio</td>
			<td>448821-C1</td>
			<td>targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine transporter 2 oligonucleotide probe</td>
			<td>ACDBio</td>
			<td>409741-C3</td>
			<td>targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phox2b oligonucleotide probe</td>
			<td>ACDBio</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td>targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining multiplex fluorescence in situ hybridization with fluorescent immunohistochemistry on fresh frozen or fixed mouse brain sections

蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は、細胞内の特定のRNA転写物の存在と空間分布を同定する分子技術です。機能的に同定されたニューロンの神経化学的表現型決定には、通常、免疫組織化学(IHC)を用いた複数の抗体(標的タンパク質)による同時標識と、 in situ ハイブリダイゼーション(標的RNA)の最適化が必要です。特定のニューロンを特徴づける「神経化学的特徴」は達成される可能性がありますが、複雑な要因には、方法を組み合わせる前にFISHとIHCの標的を検証する必要があること、および同じ組織切片内で同時に標的とする可能性のあるRNAとタンパク質の数が限られていることが含まれます。
ここでは、新鮮な凍結マウス脳調製物と固定マウス脳調製物の両方を使用して、RNAscope FISHとそれに続く蛍光免疫染色を使用して、同じ脳切片内の複数のmRNAとタンパク質をそれぞれ検出するプロトコルについて説明します。免疫組織化学的に同定された脳幹核において、少量のmRNA(ガラニン受容体1など)と高存在量のmRNA(グリシントランスポーター2など)の発現パターンを記述するために、組み合わせた方法を使用します。
FISHアッセイの下流におけるタンパク質ラベリングに関する重要な考慮事項は、組織調製やFISHプローブラベリングの最適化にとどまりません。例えば、抗体の結合と標識の特異性は、FISHプローブアッセイ内のプロテアーゼステップによって悪影響を受ける可能性があることがわかりました。プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解による切断を触媒し、FISHプローブの細胞内への侵入を促進しますが、その後のIHCアッセイで標的とされたタンパク質を消化し、オフターゲット結合を生じさせる可能性もあります。標的タンパク質の細胞内位置も、FISHプローブアッセイ後のIHCの成功に寄与する要因です。標的タンパク質が膜結合している場合、IHC特異性は維持されるのに対し、細胞質タンパク質を標的とするIHCには広範なトラブルシューティングが必要であることが観察されました。最後に、スライドマウントされた固定凍結組織の取り扱いは、新鮮な凍結組織よりも難しいことがわかりましたが、RNAscopeと組み合わせると、固定凍結組織のIHC品質が全体的に向上しました。

ここでは、マルチプレックスFISHと蛍光IHCを組み合わせて、マウスNTSでそれぞれ新鮮凍結およびパラホルムアルデヒド固定組織を使用して、GalR1およびGlyT2のmRNA発現を局在化させる方法の概要を説明します。図 1 および 図2に、これらの方法で説明した組織処理、FISHおよびIHC手順のパイプラインを示します。 表1 に、各図で使用したFISH?...

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Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

このプロトコルはmultilabel FISHおよび蛍光性のIHC信号を達成することを目標に、新しい凍結および固定マウス頭脳セクションの蛍光性in situ の交配(魚)および蛍光性のimmunohistochemistry (IHC)を、結合するための方法を記述する。IHCは細胞質および膜結合タンパク質を標的としました。

マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

このプロトコルは、蛍光RNAscopeのin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学を、新鮮凍結または固定脳製剤を使用して組み合わせたものです。この技術は、同じ組織標本中のRNAとタンパク質の標的を空間的に可視化するための高感度のin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学法の組み合わせを実証することにより、柔軟性を可能にします。この手法は、脳組織切片のマルチプレックスラベリングに適用でき、神経科学における不均一な神経集団内のmRNAおよびタンパク質の空間的構成と機能的意義の調査に役立ちます。このプロトコルは、主に新鮮凍結組織およびパラホルムアルデヒド固定組織の処理手順に焦点を当てています。凍結したばかりの脳組織の切片化を開始するには、事前に冷却したクライオスタットチャックに取り付け、14マイクロメートルの厚さの冠状切片を切断します。切片を荷電ガラス顕微鏡スライドに取り付けます。取り付けたスライドをスライドボックスに移します。次に、箱をドライアイスで摂氏マイナス80度の冷凍庫に輸送します。組織固定のために、調製したパラホルムアルデヒド溶液を濾過する。摂氏4度に冷やします。取り付けられたスライドをマイナス80°Cの冷凍庫からドライアイスに移し、すぐに冷やしたパラホルムアルデヒド溶液に15分間浸し、 新鮮凍結した組織の脱水を行い、スライドガラスが完全に乾燥していることを確認します。経心溶融固定マウントから脳を取り出した後、振動ミクロトームを使用して、厚さ30マイクロメートルの組織切片を切断します。切断した切片を凍結保護液に保管します。FISHアッセイ当日に、フリーフローティング切片を0.1モルPBSを含む12ウェル細胞培養プレートに移し、回転プラットフォームシェーカーで90〜100RPMで攪拌して凍結保護剤を洗い流します。次に、絵筆を使用して、洗浄中の剥離を防ぐためにガラス顕微鏡スライドに切片を平らに取り付け、少なくとも2時間風乾します。疎水性バリアペンを使用して、切片の周囲に疎水性バリアを描き、FISH試薬を封じ込めます。前処理に続いて、組織をプロテアーゼ溶液中でインキュベートし、メーカーのガイドラインに従ってRNAscopeプローブと2時間ハイブリダイズします。その後、逐次増幅工程および蛍光免疫組織化学検査を行う。まず、スライドをインキュベートするための加湿された光保護チャンバーを準備します。ウォーターバスで、50X洗浄バッファーとプローブを摂氏40度に10分間温めます。室温まで冷却したら、50倍のストック濃度から1X洗浄バッファー1リットルを調製します。テキスト原稿に記載されているようにプローブ混合物を調製します。プロテイナーゼ処理では、プロテイナーゼ3を組織切片に添加し、室温で30分間インキュベートします。プロテイナーゼを洗い流すには、室温で0.1モルのPBSにスライドを静かに浸し、切片が剥がれないようにします。ハイブリダイゼーションのために、プローブ混合物を組織切片に添加する。加湿した予熱したチャンバーに入れます。その後、摂氏40度で2時間インキュベートします。洗浄バッファーで組織切片を2回、2分間すすぎます。シグナル増幅には、スポイトボトルを使用して、組織切片を覆うように増幅溶液を添加し、本文に記載されているようにインキュベートします。ブロッキング溶液を組織切片に加え、室温で1時間インキュベートして、非特異的結合を防ぎます。スライドをフリックして、インキュベーション後に余分なブロッキングバッファーを除去します。次に、一次抗体で切片を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、スライドを1X TBSで3回洗浄します。二次抗体を添加し、切片を室温で2時間インキュベートします。カメラ付きの落射蛍光顕微鏡でスライドを調べます。代表的な画像を20倍の倍率で取得し、TIFファイルとして保存します。本研究では、DAPI標識の不在により、組織の品質、完全性、および細菌汚染の不在が確認されました。ユビキチンC、ペプチジルプロリルイソメラーゼB、およびRNAポリメラーゼIIA mRNAを標的とするポジティブコントロールプローブからの標識により、RNAの完全性が確認されました。NTS内のGalR1 mRNA陽性ニューロンを区別するための新鮮凍結調製物では、追加の神経化学的マーカーを使用しました。膜結合型小胞トランスポーターは明確に標識された。対照的に、PHOX2Bプロモーターの制御下で発現するチロシンヒドロキシラーゼやGFPなどの細胞質タンパク質は、かすかに観察され、明確な輪郭を欠いているため、綿状であると説明されました。細胞質GalR1 mRNAのGalR1 FISHプローブ標識は点状で、明瞭に観察された。免疫組織化学の質がタンパク質の細胞内局在に依存することを確認するために、異なる核タンパク質および細胞質タンパク質を同じ組織切片のFISHと並行して標識しました。細胞質のPHOX2B GFPは綿状の外観を呈していた。一方、核のPHOX2Bタンパク質シグナルは明瞭であり、FISHと組み合わせると、より質の高い免疫標識が確認されました。固定凍結切片をFISHと併用して実施した場合、免疫組織化学は細胞内局在に関係なく信頼性が高かった。GlyT2 mRNA陽性ニューロンは、NTS内ではなく、NTSの腹側に位置していました。GlyT2 mRNA陽性ニューロンとPHOX2B mRNA陽性ニューロンは共局在しなかった。PHOX2B mRNA陽性NTSニューロンの亜集団はチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性であり、GlyT2 mRNAを含有するものはなかった。RNAscopeは、細胞や組織におけるRNA分布を1分子分解能で可視化し、解析することができます。新しいRNA種、疾患メカニズム、遺伝子発現パターン、ニューロンの多様性、細胞間相互作用の研究を強化します。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

神経科学

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

ラピッド<em&gt;その場で</emセロトニン症候群のラットのパラホルムアルデヒド接頭辞脳にオリゴヌクレオチドプローブを使用して&gt;ハイブリダイゼーション

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...