Name: combining multiplex fluorescence in situ hybridization with fluorescent immunohistochemistry on fresh frozen or fixed mouse brain sections
Uploaded: 2021-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Australian Research Council Discovery Project grant DP180101890 og Rebecca L Cooper Medical Research Foundation prosjektstipend PG2018110

Et sammendrag av trinnene i vevsforbehandling finnes i figur 1. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med Animal Care and Ethics Committee ved University of New South Wales i samsvar med retningslinjene for bruk og pleie av dyr til vitenskapelige formål (Australian National Health and Medical Research Council).
1. Prøvepreparering av ferskt frosset hjernevev
<ol><li>Transkardial perfusjon<ol><li>Forbered heparinisert (2500 U / L) 0,1 M fosfatbuffer (PB), pH 7,...

<ol>
	<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Annese, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+dual+ISH-IHC+technology+to+study+angiogenesis+in+diffuse+large+B-cell+lymphomas.">RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas.</a> Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).</li><li>Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+in+vivo+gene+expression+during+collective+cell+migration+using+an+integrated+RNAscope,+immunohistochemistry+and+tissue+clearing+method.">Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method.</a> Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, 55 (2014).</li><li>Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+and+cell-specific+confirmation+of+RNA+and+protein+in+the+mouse+retina.">Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).</li><li>Kersigo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RNAscope+whole+mount+approach+that+can+be+combined+with+immunofluorescence+to+quantify+differential+distribution+of+mRNA.">A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA.</a> Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).</li><li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures.">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).</li><li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization.">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).</li><li>Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+and+immunofluorescence+imaging+for+detection+of+cytokine+expression+in+microglia/macrophage+cells.">Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells.</a> Bio-Protocol. 7 (22), (2017).</li><li>Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+respiratory-related+brain+regions+to+long-term+hypercapnia:+focus+on+neuropeptides+in+the+RTN.">Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).</li><li>Lazarenko, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensitivity+and+ultrastructure+of+the+retrotrapezoid+nucleus+in+Phox2b-EGFP+transgenic+mice.">Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).</li><li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections.">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).</li><li>Kerr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+knock-in+mice+expressing+fluorescently+tagged+galanin+receptors+1+and+2.">The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).</li><li>Kachidian, P., Pickel, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+tyrosine+hydroxylase+in+neuronal+targets+and+efferents+of+the+area+postrema+in+the+nucleus+tractus+solitarii+of+the+rat.">Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).</li><li>Stornetta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Phox2b+by+brainstem+neurons+involved+in+chemosensory+integration+in+the+adult+rat.">Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat.</a> Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).</li><li>Gilmor, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+putative+vesicular+acetylcholine+transporter+in+rat+brain+and+localization+in+cholinergic+synaptic+vesicles.">Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).</li><li>Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+neuropeptides+derived+from+a+common+precursor+are+differentially+packaged+and+transported.">Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported.</a> Cell. 54 (6), 813-822 (1988).</li><li>Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+tyrosine-hydroxylase+immunocytochemistry+in+paraffin+sections+using+pretreatment+with+proteolytic-enzymes.">Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).</li><li>Biancardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+excitatory,+inhibitory,+and+modulatory+afferent+projections+to+the+anatomically+defined+active+expiratory+oscillator+in+adult+male+rats.">Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).</li><li>Matthews, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+in+the+brainstem:+an+excitatory+disynaptic+pathway+for+control+of+whisking.">Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections.">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).</li><li>Yamashita, S., Katsumata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval+in+immunohistochemistry:+mechanisms+and+applications.">Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).</li><li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval:+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry.">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li></ol>

I nevrovitenskapen brukes FISH og IHC rutinemessig til å undersøke den romlige organisasjonen og funksjonelle betydningen av mRNA eller proteiner i nevronale subpopulasjoner. Protokollen beskrevet i denne studien øker kapasiteten for samtidig påvisning av mRNA og proteiner i hjerneseksjoner. Vår kombinerte multiplex FISH-IHC-analyse muliggjorde fenotypisk identifisering av distinkte nevronale subpopulasjoner i NTS i både ferske frosne og faste hjernepreparater. FISH-IHC i faste frosne vevspreparater ga pålitelige ...

Proteiner og mRNA som nevrokjemisk definerer subpopulasjoner av nevroner, identifiseres ofte med en kombinasjon av henholdsvis immunhistokjemi (IHC) og/eller in situ-hybridisering (ISH). Å kombinere ISH med IHC-teknikker letter karakteriseringen av kolokaliseringsmønstre som er unike for funksjonelle nevroner (nevrokjemisk koding) ved å maksimere multiplex merkingskapasitet.
Fluorescerende ISH (FISH) metoder, inkludert RNAscope, har høyere sensitivitet og spesifisitet sammenlignet med tidligere RNA-deteksjonsmetoder som radioaktivt ISH og ikke-radioaktivt kromogent ISH. FISH muliggjør visualisering av enkle mRNA-transkripter som punktfargede flekker1. Videre tillater RNAscope-analysen et økt antall RNA-mål å bli merket om gangen, ved hjelp av forskjellige fluoroformerker. Til tross for disse fordelene kan tekniske begrensninger påvirke antall fluoroforer / kromogener som kan brukes i et enkelt eksperiment. Disse inkluderer tilgjengeligheten av mikroskopfiltersett; Slike hensyn forsterkes når nevrokjemisk identifikasjon bruker kombinert FISH og IHC, sammenlignet med å bruke hver teknikk isolert, siden iboende trinn som er optimale for en metode, kan være skadelige for den andre.
Tidligere anvendelse av FISH kombinert med IHC har vist uttrykk for spesifikke cellulære mål i humane B-celle lymfomer2, kyllingembryoer3, sebrafiskembryoer4, musenetthinne5 og muse indre øreceller6. I disse studiene var vevspreparering enten formalinfiksert parafin innebygd (FFPE)2,3,5 eller fersk helmontering 4,6. Andre studier brukte kromogent RNAscope på faste mus- og rottehjernepreparater 7,8,9. Spesielt Baleriola et al.8 beskrev to forskjellige vevspreparater for kombinert ISH-IHC; faste musehjerneseksjoner og FFPE-menneskelige hjerneseksjoner. I en nylig publikasjon kombinerte vi FISH og fluorescerende IHC på ferske frosne seksjoner, for samtidig å visualisere mRNA med lav overflod (galaninreseptor 1, GalR1), mRNA med høy mengde (glycintransportør 2, GlyT2) og vesikulær acetylkolintransportør (vAChT) protein10 i hjernestammens retikulære formasjon.
Kjernen i ensomhetskanalen (NTS) er en stor hjernegruppe involvert i autonom funksjon. Ligger i bakveien, mottar og integrerer denne heterogene populasjonen av nevroner et stort antall autonome signaler, inkludert de som regulerer pusten. NTS har flere nevronpopulasjoner, som kan være fenotypisk preget av ekspresjonsmønsteret til mRNA-mål, inkludert GalR1 og GlyT2 og proteinmarkører for enzymet tyrosinhydroksylase (TH) og transkripsjonsfaktoren Par-lignende homeobox 2b (Phox2b).
RNAscope-innehaveren anbefaler ferske frosne vevspreparater, men vev fremstilt ved heldyrs transkardiale perfusjonsfiksering, sammen med langvarig kryoproteksjon (lagring ved -20 °C) av faste frosne vevsseksjoner, er vanlig i mange laboratorier. Derfor søkte vi å etablere protokoller for FISH i kombinasjon med IHC ved bruk av ferske frosne og faste frosne vevspreparater. Her sørger vi for ferske frosne og faste frosne hjerneseksjoner: (1) en protokoll for kombinert FISH og fluorescerende IHC (2) en beskrivelse av kvaliteten på produsert mRNA og proteinmerking, ved bruk av hvert preparat (3) en beskrivelse av uttrykket av GalR1 og GlyT2 i NTS.
Vår studie viste at, kombinert med RNAscope-metodikk, varierte IHC-suksessen i ferske frosne og faste frosne preparater, og var avhengig av lokalisering av målproteinene i cellen. I våre hender var membranbundet proteinmerking alltid vellykket. IHC for cytoplasmatisk protein krevde derimot feilsøking selv i tilfeller der cytoplasmatisk protein ble overuttrykt i et transgent dyr (Phox2b-GFP)11. Til slutt, mens GalR1 uttrykkes i ikke-katekolaminerge nevroner i NTS, er GlyT2-uttrykk fraværende i NTS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
			<td>Australian BioResources, Moss Vale</td>
			<td>MGI: 2159769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phox2b-eGFP mouse</td>
			<td>Australian BioResources, Moss Vale</td>
			<td>MGI: 5776545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Sodium</td>
			<td>Clifford Hallam Healthcare</td>
			<td>1070760</td>
			<td>Consult local veterinary supplier or pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade agarose powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, 118mL</td>
			<td>Scigen Ltd</td>
			<td>4586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, prilled, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000&#160; (PVP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>With or without DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)</td>
			<td>ADV320850</td>
			<td>Includes 50x Wash buffer and Protease III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop incubator</td>
			<td>Thermoline scientific micro incubator</td>
			<td>Model: TEI-13G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drawing-up needle (23 inch gauge)</td>
			<td>BD</td>
			<td>0288U07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimberley Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Coleparmer Masterflex</td>
			<td>L/S Series&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 2000R Digital Camera</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>RET-2000R-F-CLR</td>
			<td>colour camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Glass Slides (White)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome (Vibratome)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA1001110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CorelDRAW&#160;</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td>Version 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (ImageJ Distribution)</td>
			<td>Open Source/GNU General Public Licence (GPL)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. &#38; Hiner, M. C. et al. (2017), &#34;ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data&#34;, BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z&#160;&#160; and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. &#38; Frise, E. et al. (2012), &#34;Fiji: an open-source platform for biological-image analysis&#34;, Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMARY ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB1542</td>
			<td>Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB318</td>
			<td>Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ABN100</td>
			<td>Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-308</td>
			<td>Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phox2b Antibody (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SECONDARY ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>713-155-147</td>
			<td>Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td>Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>713-175-147</td>
			<td>Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNASCOPE PROBES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe</td>
			<td>ACDBio</td>
			<td>448821-C1</td>
			<td>targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine transporter 2 oligonucleotide probe</td>
			<td>ACDBio</td>
			<td>409741-C3</td>
			<td>targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phox2b oligonucleotide probe</td>
			<td>ACDBio</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td>targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining multiplex fluorescence in situ hybridization with fluorescent immunohistochemistry on fresh frozen or fixed mouse brain sections

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) er en molekylær teknikk som identifiserer tilstedeværelsen og romlig fordeling av spesifikke RNA-transkripter i celler. Nevrokjemisk fenotyping av funksjonelt identifiserte nevroner krever vanligvis samtidig merking med flere antistoffer (målrettingsprotein) ved bruk av immunhistokjemi (IHC) og optimalisering av in situ hybridisering (rettet mot RNA), i tandem. En "nevrokjemisk signatur" for å karakterisere bestemte nevroner kan oppnås, men kompliserende faktorer inkluderer behovet for å verifisere FISH- og IHC-mål før man kombinerer metodene, og det begrensede antallet RNA og proteiner som kan målrettes samtidig innenfor samme vevsseksjon.
Her beskriver vi en protokoll, ved hjelp av både ferske frosne og faste musehjernepreparater, som oppdager flere mRNA og proteiner i samme hjerneseksjon ved hjelp av henholdsvis RNAscope FISH etterfulgt av fluorescensimmunfarging. Vi bruker den kombinerte metoden for å beskrive ekspresjonsmønsteret av mRNA med lav overflod (f.eks. galaninreseptor 1) og mRNA med høy mengde (f.eks. glycintransportør 2), i immunhistokjemisk identifiserte hjernestammekjerner.
Viktige hensyn for proteinmerking nedstrøms for FISH-analysen strekker seg utover vevspreparering og optimalisering av FISH-sondemerking. For eksempel fant vi at antistoffbinding og merkingsspesifisitet kan bli skadelig påvirket av proteasetrinnet i FISH-sondeanalysen. Proteaser katalyserer hydrolytisk spaltning av peptidbindinger, noe som letter FISH-sondens inntreden i celler, men de kan også fordøye proteinet som er målrettet av den påfølgende IHC-analysen, og produsere målbinding. Den subcellulære plasseringen av det målrettede proteinet er en annen faktor som bidrar til IHC-suksess etter FISH-sondeanalysen. Vi observerte at IHC-spesifisiteten ble beholdt når det målrettede proteinet er membranbundet, mens IHC-målretting mot cytoplasmatisk protein krevde omfattende feilsøking. Til slutt fant vi håndtering av glidemontert fast frosset vev mer utfordrende enn ferskt frosset vev, men IHC-kvaliteten var generelt bedre med fast frosset vev, kombinert med RNAscope.

Her skisserer vi en metode for å kombinere multiplex FISH med fluorescerende IHC for å lokalisere mRNA-uttrykk for GalR1 og GlyT2 ved bruk av henholdsvis ferskfrosset og paraformaldehydfiksert vev i musens NTS. En pipeline av vevsprosesserings-, FISH- og IHC-prosedyrene beskrevet i metodene er vist i figur 1 og figur 2. Tabell 1 gir et sammendrag av FISH-sonden og antistoffkombinasjonene som er brukt i hver figur.
K...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections at JoVE.com

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Denne protokollen beskriver en metode for å kombinere fluorescens in situ hybridisering (FISH) og fluorescens immunhistokjemi (IHC) i både ferske frosne og faste musehjerneseksjoner, med mål om å oppnå multilabel FISH og fluorescens IHC-signal. IHC målrettet cytoplasmatiske og membranfestede proteiner.

Kombinere multiplex fluorescens in situ hybridisering med fluorescerende immunhistokjemi på ferske frosne eller faste musehjerneseksjoner

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Denne protokollen kombinerer fluorescens RNAscope in situ hybridisering og immunhistokjemi ved bruk av ferskfrosne eller faste hjernepreparater. Denne teknikken tillater fleksibilitet ved å demonstrere en kombinasjon av svært følsomme in situ-hybridiserings- og immunhistokjemimetoder for romlig visualisering av RNA- og proteinmål i samme vevsprøve. Denne metoden er anvendelig for multiplex merking i hjernevevsseksjonen, som hjelper undersøkelsen av romlig organisasjon og funksjonell betydning av mRNA og proteiner i heterogene nevronpopulasjoner i nevrovitenskap.Denne protokollen fokuserer hovedsakelig på behandlingstrinn for ferskfrosset vev og paraformaldehydfiksert vev. For å begynne å seksjonere det ferskfrosne hjernevevet, fest det til den forkjølte kryostatchucken og kutt 14 mikrometer tykke koronale seksjoner. Monter seksjonen på et ladet glassmikroskopilysbilde.Overfør det monterte lysbildet til en lysbildeboks. Deretter transporteres boksen til fryseren på minus 80 grader Celsius på tørris. For vevfiksering, filtrer den fremstilte paraformaldehydoppløsningen.Avkjøl den til 4 grader Celsius. Ta det monterte lysbildet fra minus 80 grader Celsius fryseren på tørris og senk den umiddelbart i den forkjølte paraformaldehydløsningen i 15 minutter, Utfør dehydrering av ferskt frosset vev for å sikre at glassglasset er helt tørt. Etter å ha fjernet hjernen fra et transkardial overflod fast feste, ved hjelp av en vibrerende mikrotom, kutt 30 mikrometer tykke vevsseksjoner.Oppbevar kuttseksjonene i kryobeskyttelsesmiddelløsning. På dagen for FISH-analysen, overfør den frittflytende delen til en 12-brønns cellekulturplate inneholdende 0,1 molar PBS og beveg den ved 90 til 100 RPM på en roterende plattformrister for å vaske av kryobeskyttelsesmiddel. Deretter bruker du en pensel til å montere seksjonen flatt på et glassmikroskopiglass for å forhindre løsrivelse under vask, og lufttørker i minst to timer.Bruk en hydrofob barrierepenn til å tegne en hydrofob barriere rundt seksjonen for å inneholde FISH-reagensene. Etter forbehandling inkuberes vevet i proteaseoppløsning og hybridiseres med RNAscope-sonder i to timer i henhold til produsentens retningslinjer. Deretter utføres sekvensielle amplifikasjonstrinn og fluorescensimmunhistokjemi.Start med å forberede et fuktet lysbeskyttet kammer for inkubering av lysbilder. I et vannbad, varm 50X vaskebuffer og sonder til 40 grader Celsius i 10 minutter. Når den er avkjølt til romtemperatur, tilbered en liter 1X vaskebuffer fra 50X lagerkonsentrasjonen.Forbered sondeblandingen som beskrevet i tekstmanuskriptet. For proteinasebehandling, tilsett proteinase 3 på vevsseksjonen og inkuber den ved romtemperatur i 30 minutter. For å vaske av proteinasen, senk lysbildet forsiktig i 0,1 molar PBS ved romtemperatur, og unngå at delen løsner.For hybridisering, tilsett sondeblandingen på vevsseksjonen. Plasser den i det fuktige, forvarmede kammeret. Deretter inkuberer den i to timer ved 40 grader Celsius.Skyll vevseksjonen med vaskebuffer to ganger i to minutter. For signalforsterkning, bruk en dryppflaske, tilsett en forsterkningsløsning for å dekke vevsseksjonen og inkubere som beskrevet i teksten. Legg den blokkerende oppløsningen på vevsseksjonen og inkuber i en time ved romtemperatur for å forhindre uspesifikk binding.Sveip lysbildet for å fjerne overflødig blokkeringsbuffer etter inkubering. Nå inkuberer du seksjonen med primære antistoffer over natten ved 4 grader Celsius. Neste dag, vask lysbildet tre ganger med 1X TBS.Tilsett det sekundære antistoffet og inkuber seksjonene i to timer ved romtemperatur. Undersøk lysbildet under et epifluorescensmikroskop utstyrt med et kamera. Skaff representative bilder ved 20 ganger forstørrelse og lagre dem som TIF-filer.I denne studien ble vevskvaliteten, integriteten og fraværet av bakteriell forurensning bekreftet ved fravær av DAPI-merking. Merking fra positive kontrollprober rettet mot ubiquitin C, peptidylprolylilisomerase B og RNA-polymerase IIA mRNA bekreftet RNA-integritet. I nyfrosne preparater for å skille GalR1 mRNA-positive nevroner i NTS ble ytterligere nevrokjemiske markører brukt.Den membranbundne vesikulære transportøren var tydelig merket. I motsetning til dette ble cytoplasmatiske proteiner som tyrosinhydroksylase og GFP uttrykt under kontroll av PHOX2B-promotor svakt observert og beskrevet som flokkulente da de mangler en klar kontur. GalR1 FISH-sondemerking av cytoplasmatisk GalR1 mRNA var punktert og tydelig observert.For å bekrefte at immunhistokjemiens kvalitet avhenger av subcellulær proteinlokalisering, ble forskjellige nukleære og cytoplasmatiske proteiner merket parallelt med FISH i de samme vevssnittene. Den cytoplasmatiske PHOX2B GFP hadde et flokkulerende utseende. Mens det nukleære PHOX2B-proteinsignalet var klart, noe som bekreftet immunmerking av høyere kvalitet når det ble kombinert med FISH.Ved utført på faste fryste snitt i kombinasjon med FISH var immunhistokjemi pålitelig uavhengig av subcellulær lokalisasjon. GlyT2 mRNA-positive nevroner var lokalisert ventrale til NTS og ikke innenfor NTS. GlyT2 mRNA-positive og PHOX2B mRNA-positive nevroner kolokaliserte ikke.En underpopulasjon av PHOX2B mRNA-positive NTS-nevroner var tyrosinhydroksylaseimmunoreaktive, og ingen inneholdt GlyT2 mRNA. RNAscope muliggjør visualisering og analyse av RNA-distribusjon ved enkeltmolekyloppløsning i celler og vev. Det gir forskning i nye RNA-arter, sykdomsmekanismer, genuttrykksmønstre, nevrondiversitet og cellulære interaksjoner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Påvisning av Genome og transkripsjoner av en vedvarende DNA virus i nerve vev ved Fluorescent In situ Hybridisering Kombinert med Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Påvisning av Axonally Lokalisert mRNAs i hjernedelene med høy oppløsning<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering bruker oligonukleotidprober på Paraformaldehyde-prefiks Brain of Rats med serotonergt syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Kombinere Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering med immunomerking for Påvisning av Expression of Three Gener i musehjerne §§

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS) og Gene Expression Analyse av Fos-uttrykker Nerveceller fra fersk og fryst Rat hjernevev

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering av Cerebral kapillærer fra friske menneskelige hjernevev

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...