Name: simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes
Uploaded: 2020-09-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes at JoVE.com

Agradecemos a Ernst H. K. Stelzer por la oportunidad de utilizar sus recursos, así como sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, Anita Anderl por su apoyo con las imágenes en vivo de Tribolium, Sven Plath por el apoyo técnico, así como a Ilan Davis, Nicole Grieder y Gerold Schubiger por compartir sus líneas transgénicas de Drosophila a través del Bloomington Stock Center.

1. Trabajos preparatorios
<ol><li>Elija una combinación de lente de iluminación/lente de detección/cámara para el LSFM que se adapte a la pregunta científica y configure el microscopio. El tamaño del campo de visión es el cociente del tamaño del chip de la cámara y el aumento de la lente de detección. La lente de iluminación debe elegirse de modo que todo el campo de visión esté cubierto por una hoja de luz aproximadamente plana34. En la Tabla 1se enumeran tres comb...

Una de las áreas de aplicación exclusivas de LSFMs es la biología del desarrollo. En esta disciplina, es importante observar especímenes vivos, de lo contrario los procesos morfogenéticos no se pueden describir de manera dinámica. Un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea en LSFMs cámara-basados de la muestra, según lo descrito aquí, es conveniente por dos razones principales.
La varianza ambiental, que es inevitable en imágenes en vivo secuenciales, se pue...

La microscopía de fluorescencia es una de las técnicas de imagen más esenciales en las ciencias de la vida, especialmente en biología celular y del desarrollo. En los microscopios de fluorescencia confocal1,que son de última generación para imágenes de fluorescencia tridimensionales desde mediados de la década de 1990, la misma lente se utiliza para la excitación de fluoróforos y la detección de luz de emisión. El rayo láser de iluminación excita todos los fluoróforos a lo largo del eje de iluminación/detección y la señal de desfoque respectiva se discrimina antes de la detección por un agujero de alfiler. Por lo tanto, para cada imagen bidimensional, se ilumina todo el espécimen. En consecuencia, para cada imagen tridimensional, es decir, una pila de imágenes bidimensionales espacialmente consecutivas, todo el espécimen se ilumina varias docenas a unos pocos cientos de veces2,lo que promueve el fotoblanqueo y la fototoxicidad3.
Hace casi veinte años, la tecnología basada en láminas de luz4 surgió como una alternativa prometedora para las imágenes tridimensionales de fluorescencia y, por lo tanto, se convirtió en una herramienta valiosa en la biología del desarrollo5. En este enfoque, la iluminación y la detección están desacopladas. La lente de iluminación se utiliza para generar una hoja de luz con una profundidad de sólo unos pocos micrómetros dentro del plano focal de la lente de detección dispuesta perpendicularmente. Por lo tanto, para cada imagen bidimensional, solo se ilumina un volumen plano delgado alrededor del plano focal. En consecuencia, para cada imagen tridimensional, todo el espécimen se ilumina una sola vez, lo que disminuye fuertemente el fotoblanqueo y la fototoxicidad6. Por esta razón, los microscopios de fluorescencia de láminas de luz (LSFMs) ofrecen soluciones eficientes para estudiar procesos complejos en múltiples escalas biológicamente relevantes y son, por lo tanto, de particular valor en biología del desarrollo, donde especímenes tan grandes como varios milímetros tienen que ser analizados a nivel subcelular.
Históricamente, los LSFMs han sido de muestra basados encámaras 7,8. En estas configuraciones, los ejes de iluminación (x) y detección (z) generalmente se organizan perpendicularmente al eje de gravedad (y). Las cámaras de muestras ofrecen una amplia libertad experimental. En primer lugar, proporcionan grandes capacidades de tampón de imágenes, lo que a su vez facilita el uso de un sistema de perfusión para controlar el medio ambiente, por ejemplo, para mantener una temperatura específica9 o para aplicar estresores bioquímicos. Además, admiten métodos de montaje personalizados10 que se adaptan a las respectivas necesidades experimentales, preservando al mismo tiempo la integridad tridimensional, en algunos casos dinámica11,de la muestra. Además, las configuraciones basadas en cámaras de muestra generalmente están equipadas con una función de rotación que se utiliza para girar las muestras alrededor del eje y y, por lo tanto, obtener imágenes a lo largo de dos, cuatro o incluso más direcciones. Puesto que los embriones de organismos modelo de uso general son, en el contexto de microscopia, relativamente grandes, la proyección de imagen sucesiva a lo largo de las hachas ventral-dorsales, laterales, y/o anterior-posteriores del cuerpo proporciona una representación más comprensiva. Esto permite, por ejemplo, el seguimiento a largo plazo de las células que se mueven a lo largo de complejas rutas de migracióntridimensionales 12,13.
La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz se ha aplicado ampliamente para estudiar la morfogénesis embrionaria de Drosophila melanogaster,tanto sistemáticamente14,15 como con un enfoque específico en los aspectos biofísicos del desarrollo. Por ejemplo, se utilizó para recopilar datos morfogenéticos de alta resolución con el fin de detectar un vínculo biomecánico entre la invaginación del endodermo y la extensión del eje durante el alargamiento de la banda germinal16 y, además, para relacionar el flujo celular complejo con los patrones de generación de fuerza durante la gastrulación17. También se ha combinado con otras técnicas de vanguardia, por ejemplo, optogenética para investigar la regulación de la señalización de Wnt durante el patrón anterior-posterior en la epidermis18.
Sin embargo, el estudio de una sola especie no proporciona información sobre la evolución del desarrollo. Para comprender la embriogénesis dentro del contexto filogenético, se ha llevado a cabo una investigación intensiva con organismos modelo de insectos alternativos. Una de las especies más investigadas es el escarabajo de la harina roja Tribolium castaneum,una plaga de grano almacenado económicamente relevante19,cuya morfogénesis embrionaria también ha sido sistemáticamente fotoizada con LSFM20. La morfogénesis embrionaria de estas dos especies difiere notablemente en varios aspectos, por ejemplo, el modo de segmentación21,así como la formación y degradación de membranas extraembrionarias22. Este último aspecto ya ha sido ampliamente analizado utilizando LSFMs. Por ejemplo, se ha demostrado que la serosa, un tejido extraembrionario que envuelve y protege al embrión de Tribolium de diversos peligros para la mayor parte de su embriogénesis23,24,también actúa como el "conductor" morfogenético para su propio proceso de retirada durante el cierre dorsal25. Además, se ha demostrado que durante la gastrulación, una región particular del blastodermo permanece anclada a la membrana vitelina para crear movimientos tisulares asimétricos26 y, tras esta observación, que la fluidización tisular regionalizada permite a las células salir secuencialmente del borde de la serosa durante el cierre de la ventana de la Serosa27.
En todos los estudios asociados a Drosophilay Triboliumcitados anteriormente, se han utilizado LSFMs basados en cámaras de muestra. En la mayoría, los embriones se registraron a lo largo de múltiples direcciones utilizando la función de rotación de la muestra. Aunque no se indica explícitamente, se puede suponer que se han registrado individualmente y, por lo tanto, independientes entre sí en ensayos secuenciales de imágenes en vivo, similar a nuestro trabajo anterior en Tribolium20,28. En ciertos escenarios, tal enfoque es aceptable, pero especialmente en los enfoques comparativos cuantitativos, la varianza ambiental puede distorsionar los resultados. Por ejemplo, desde hace mucho tiempo se sabe que la velocidad de desarrollo de los insectos depende de la temperatura29,pero un estudio más reciente sugiere además que en Drosophila,la temperatura también puede afectar la concentración de morfógenos30. En consecuencia, si ciertas características de la embriogénesis, por ejemplo, las proporciones dinámicas, las tasas de división y las velocidades de migración de las células, deben cuantificarse con precisión, se requieren suficientes repeticiones sin varianza ambiental. Esto minimiza las desviaciones estándar y los errores estándar, lo que a su vez facilita la yuxtaposición con otras condiciones experimentales, incluso marginalmente divergentes.
Sin embargo, los LSFMs basados en cámaras de muestras están diseñados principalmente para ensayos de alto contenido en lugar de ensayos de alto rendimiento. A diferencia de los microscopios confocales, que normalmente están equipados con mecanismos de abrazadera estandarizados para portaobjetos de microscopía, placas de Petri y placas de pozos, casi todos los LSFMs basados en cámaras de muestras utilizan mecanismos de abrazadera basados en cilindros. Estos mecanismos están destinados a portamuebadores de muestras a medida que son compatibles con la rotación, así como no invasivos10,pero por lo general no diseñados para más de una muestra20,31,32. Un marco para la obtención simultánea de imágenes en vivo de dos o más embriones, en el que las ventajas de las configuraciones basadas en cámaras de muestras no se ven comprometidas, aborda el problema de la varianza ambiental, lo que aumenta el valor de los LSFMs para estudios comparativos.
En nuestro protocolo, presentamos un marco experimental para la proyección de imagen viva comparativa en LSFMs cámara-basada de la muestra(figura 1A)en el cual el eje de y se utiliza como opción para "apilar" embriones. En primer lugar, proporcionamos una guía de calibración fluorescente basada en microesfera para LSFMs basados en cámaras de muestras, que es especialmente importante para los instrumentos que carecen de un asistente de calibración. En segundo lugar, describimos un método de montaje para múltiples embriones basado en el soporte de telaraña28 (Figura 1B)que es compatible con la rotación de la muestra y, por lo tanto, permite la obtención simultánea de imágenes de múltiples especímenes a lo largo de múltiples direcciones(Figura 1C). Varios embriones se alinean en la parte superior de una fina película de agarosa y, después de la inserción en la cámara de muestra, se mueven sucesivamente a través de la lámina de luz para adquirir imágenes tridimensionales. En tercer lugar, proporcionamos tres conjuntos de datos de imágenes en vivo ejemplares para Drosophila, así como para Tribolium. Para los primeros, yuxtaponemos líneas transgénicas con núcleos marcados fluorescentemente. Para este último, comparamos el rendimiento de las sublíneas transgénicas que llevan el mismo transgén, pero en diferentes ubicaciones genómicas. Finalmente, discutimos la importancia de la paralelización con respecto a la proyección de imagen viva comparativa y la variación ambiente33,debatimos el límite de rendimiento de nuestro marco experimental y evaluamos la adaptación de nuestro enfoque a otros organismos modelo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430500</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430300</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm &#216; Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-mm &#216; Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L9004575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-&#181;m mesh size cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-038</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-040</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>710-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-050</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-051</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 fine wheat flour</td>
			<td>Demeter e.V.</td>
			<td>SP061006</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>commercially available Drosophila medium</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-115</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microspheres, 1.0 &#181;m &#216;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inactive dry yeast</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-108</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-melt agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small paint brush</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>149-2121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td>Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>whole wheat flour</td>
			<td>Demeter e.V.</td>
			<td>SP061036</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wide vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-110</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes

La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz ofrece soluciones eficientes para estudiar procesos complejos en múltiples escalas biológicamente relevantes. Las configuraciones basadas en cámaras de muestras, que están diseñadas específicamente para preservar la integridad tridimensional de la muestra y generalmente cuentan con rotación de muestras, son la mejor opción en biología del desarrollo. Por ejemplo, se han utilizado para documentar toda la morfogénesis embrionaria de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y el escarabajo de la harina roja Tribolium castaneum. Sin embargo, muchos protocolos de imágenes en vivo disponibles proporcionan solo marcos experimentales para embriones individuales. Especialmente para los estudios comparativos, tales enfoques son inconvenientes, ya que las muestras con imágenes secuenciales se ven afectadas por la varianza ambiental. Además, esto limita el número de especímenes que se pueden ensayado dentro de un tiempo determinado. Proporcionamos un marco experimental para imágenes simultáneas en vivo que aumenta el rendimiento en configuraciones basadas en cámaras de muestras y, por lo tanto, garantiza condiciones ambientales similares para todas las muestras. En primer lugar, proporcionamos una guía de calibración para microscopios de fluorescencia de láminas de luz. En segundo lugar, proponemos un método de montaje para múltiples embriones que sea compatible con la rotación de muestras. En tercer lugar, proporcionamos conjuntos de datos de imágenes en vivo tridimensionales ejemplares de Drosophila,para lo cual yuxtaponemos tres líneas transgénicas con núcleos marcados fluorescentemente, así como de Tribolium,para lo cual comparamos el rendimiento de tres sublíneas transgénicas que llevan el mismo transgén, pero en diferentes ubicaciones genómicas. Nuestro protocolo está diseñado específicamente para estudios comparativos, ya que aborda de forma proactiva la varianza ambiental, que siempre está presente en las imágenes en vivo secuenciales. Esto es especialmente importante para los análisis cuantitativos y la caracterización de fenotipos aberrantes, que resultan, por ejemplo, de experimentos knockout. Además, aumenta el rendimiento general, lo que es muy conveniente cuando el acceso a los microscopios de fluorescencia de láminas de luz es limitado. Finalmente, el método de montaje propuesto se puede adaptar para otras especies de insectos y otros organismos modelo, por ejemplo, el pez cebra, básicamente sin esfuerzo de optimización.

Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva de la fluorescencia comparativa en LSFMs basado cámara de la muestra. Por ejemplo, el marco se puede utilizar para yuxtaponer (i) embriones de dos o más especies, (ii) embriones de líneas en las que uno o más genes son eliminados más controles de tipo salvaje, (iii) múltiples embriones de la misma línea transgénica, (iv) embriones de diferentes líneas transgénicas, o (v) embriones de sublíneas que portan el mismo transgén , pe...

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Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz es la herramienta más valiosa en biología del desarrollo. Un problema importante en los estudios comparativos es la varianza ambiental. Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea de especímenes múltiples y, por lo tanto, trata este problema favorablemente activamente.

Imágenes simultáneas en vivo de múltiples embriones de insectos en microscopios de fluorescencia de hoja de luz basados en cámaras de muestra

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Sample Chamber-Based Light Sheet Florescence Microscopes are designed for high content rather than high throughput. Live imaging assays must therefore be performed sequentially and thus less affected by ambient variance. Our cobweb holder allow stacking and simultaneous imaging of multiple embryos, eliminating ambient variance and increasing throughput.Mounting embryos in the cobweb holder requires a certain finesse. An explainatory video is ideal for illustrating sequence of the many short conduct gestures. For calibration of the Sample Chamber-Based of Light Sheet Fluorescence Microscope.First, reliquify an agarose aliquot in a dry block heater mixer at 80 degrees Celsius. Allow the melted agarose to cool to 35 degrees Celsius and transfer 50 microliters of the agarose to a 1.5 milliliter reaction tube. Mix 0.5 microliters of fluorescent microsphere solution with the agarose at 1, 400 revolutions per minute for one minute, and fill the slotted hole of the cobweb holder with 10 microliters of the agarose fluorescent microsphere solution mixture.Aspirate as much agarose as possible until only a thin agarose film remains and allow the agarose to solidify for 30 to 60 seconds. Fill the sample chamber with autoclaved tap water, and slowly insert the cobweb holder into the sample chamber. Move the slotted hole in front of the detection lens and rotate the holder to a 45 degree position relative to the illumination and detection axes.The cobweb holder should not be visible in the transmission light channel. Switch to the appropriate fluorescence channel and adjust the laser power and exposure time, so that the fluorescent microspheres provide a proper signal. Specify a volume of view that covers the now transversely oriented agarose film completely and calculate the maximum possible axial resolution for the respective illumination and detection lens combination to define the Z spacing.Then, record a three-dimensional test Z stack of the fluorescent microspheres and compare the X, Y, and Z maximum projections to the calibration chart. If the microspheres appear blurry, fuzzy, and or distorted. Adjust the positions of the illumination and or detection lenses.For embryo dechorionation, add eight milliliters of autoclaved tap water into the A1, A2, A3 and B3 wells of one-six-well plate per line. Then, add seven milliliters of autoclaved tap water and one milliliter of sodium hypochlorite solution into the B1 and B2 wells. Position the first plate under a stereo microscope and insert first embryo containing cell strainer into the A1 well.Wash the embryos under gentle agitation for 30 to 60 seconds, before moving the strainer to the B1 well. Shake the plate vigorously for 30 seconds, before transferring the strainer to the A2 well. Wash the embryos for one minute under gentle agitation and move the strainer into the B2 Well for vigorous shaking until most of the embryos are completely dechorionation.Then, transfer the strainer to the A3 well for one minute of gentle washing, before storing the strainer of dechorionated embryos in the B3 well until the embryos of other lines have been treated as demonstrated. To Mount the embryos onto the cobweb holder, reliquify another aliquot of agarose as demonstrated. When the agarose has cooled, place the cobweb holder under the stereo microscope and add 10 microliter of the agarose onto the slotted hole.Use the pipette tip to spread the agarose over the slotted hole, before aspirating as much agarose as possible until only a thin agarose film remains. When the agarose has solidified, use a paintbrush to carefully pick and transfer the embryos onto the agarose film. Arrange them along the long axis of the slotted hole with their anterior-posterior axes aligned with the long axis of the slotted hole.To stabilize the embryos, carefully pipette one to two microliters of agarose into the gap between the embryos and the agarose film. When the agarose has solidified, slowly insert the cobweb holder with the mounted embryos into the image buffer filled sample chamber. To image the embryos, confirm that the cobweb holder is in a 45 degree position relative to the illumination and detection axes and in the transmission light channel, move the embryo into the center of the field of view.The cobweb holder should not be visible. Next, move the embryo with the micro translation stage in Z until the mid plane of the embryo overlaps with the focal plane and the outline appear sharp. Without switching to the fluorescence channel, move the embryo 250 microns in both directions to specify the volume of view.If imaging along multiple directions is required, rotate the embryo appropriately, bring the embryo into focus and specify the volume of view as just demonstrated. Then, repeat this procedure for all of the other mounted embryos. When the volume of view has been specified for all of the embryos, define the fluorescence channel and time-lapse parameters and start the imaging process.For assays that lasts several days, consider covering the sample chamber opening at least partially to reduce evaporation. When the imaging assay has ended, carefully remove the cobweb holder from the sample chamber and use a small paintbrush to detach the embryos from the agarose film and to place the embryos onto an appropriately labeled microscope slide. Place the slide into a retrieval dish for incubation under the appropriate standard rearing conditions.As the hatching time point approaches, check the retrieval dishes frequently and transfer any hatched larvae to individual wells of a 24-well plate. Fill the Wells halfway with the appropriate growth medium, then incubate the larvae under the appropriate standard rearing conditions. When the observed individuals reach adulthood, provide suitable mating partners and check for progeny after several days.In this video, the fluorescent signal dynamics of three embryos derived from different transgenic Drosophila lines over a period of about one day can be observed. A similar fluorescence pattern was expected since all of the lines expressed nuclear localized EGFP under the control of presumably ubiquitous and constituently active promoters. Comparative live imaging results, however, revealed strong spatial temporal differences in the expression patterns that were not secondary effects due to ambient variance.In this analysis of three Tribolium embryos carrying the same piggyback based transgene. Comparative live imaging results of the serosa window closure process during gastrulation suggest that the second sub-line provides a remarkably stronger overall signal than the other two sublines. As these data indicate, the genomic context may also have a strong influence on the expression level of transgenes in Tribolium.Our approach is well suited for analyzing knockdown and knockout phenotypes, as it allows wild type control embryos to be imaged simultaneously. Our protocol can also be used to compare the morphogenesis of two or more insect species. And thus, gain deeper insights into the evolution of development.

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Investigación

Biología

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Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

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Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

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Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

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