Name: isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells
Uploaded: 2021-05-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Curtis Vande Stouwe for hans tekniske bistand. Den forskning, der ligger til grund for udviklingen af protokollerne, blev støttet af tilskud fra National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 og 1F31AA028459-01).

Alle opnåede væv og procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Louisiana State University Health Sciences Center og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institute of Health (NIH-publikation nr. 85-12, revideret 1996).
1. Fremstilling af buffere og opløsninger
<ol><li>Der fremstilles steril 5-phosphatbufferet saltvandsvaskebuffer (5-PBS) opløsning ved tilsætning af 5% penicillin/streptomycin (pen/strep) og 0,25 μg/ml svampeh?...

<ol>
	<li>Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+interleukins+and+other+inflammatory+cytokines+by+human+adipose+tissue+is+enhanced+in+obesity+and+primarily+due+to+the+nonfat+cells.">Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells.</a> Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).</li><li>Ibrahim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue:+structural+and+functional+differences.">Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences.</a> Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).</li><li>Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+function+of+adipocytes+in+the+physiology+of+white+adipose+tissue.">The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).</li><li>Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+mesenchymal+Stem+Cells+from+different+sources.">Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources.</a> Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).</li><li>Horwitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+the+nomenclature+for+MSC:+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).</li><li>Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+in+tissue+regeneration:+A+Review.">Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review.</a> International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).</li><li>Smith, U., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+regulates+insulin+sensitivity:+role+of+adipogenesis,+de+novo+lipogenesis+and+novel+lipids.">Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids.</a> Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).</li><li>Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+pathophysiology:+the+role+of+adipose+tissue.">Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue.</a> Nutrition, Metabolism &amp; Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).</li><li>Grundy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+and+metabolic+syndrome:+too+much,+too+little+or+neither.">Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither.</a> European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).</li><li>Neeland, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+adiposity+and+the+risk+of+prediabetes+and+type+2+diabetes+in+obese+adults.">Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults.</a> Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).</li><li>Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+adipose+tissue+and+adipocyte+function+in+the+pathogenesis+of+metabolic+syndrome.">Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).</li><li>Sarjeant, K., Stephens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis.">Adipogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (9), 008417 (2012).</li><li>Ford, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chronic+binge+alcohol+and+antiretroviral+therapy+to+metabolic+dysregulation+in+SIV-infected+male+macaques.">Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).</li><li>Gagliardi, C., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rhesus+adipose-derived+stem+cells.">Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).</li><li>Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+isolation,+expansion+and+differentiation.">Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodologies+for+the+study+of+adipose+biology:+insights+gained+and+opportunities+ahead.">Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead.</a> Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).</li></ol>

ADSC-isolations-, sprednings- og differentieringsprotokoller er ligetil og reproducerbare, men de kræver omhyggelig teknik for at sikre tilstrækkelig isolation, sund ekspansion og effektiv differentiering. Et sterilt arbejdsmiljø er afgørende for alle cellekultureksperimenter. Bakterier eller svampe kan indføres i cellekulturer gennem forurenede værktøjer, medier eller arbejdsmiljø. Svampeforurening er indikeret ved sporevækst i kulturen, mens bakteriel forurening indikeres ved tilstedeværelsen af turbiditet af...

Fedtvæv består af en heterogen blanding af celler, overvejende modne adipocytter og en stromal vaskulær fraktion, herunder fibroblaster, immunceller og fedtafledte stamceller (ADSC'er)1,2,3. Primære ADSC'er kan isoleres direkte fra hvidt fedtvæv og stimuleres til at differentiere sig til adipocytter, brusk eller knogleceller4. ADSC'er udviser klassiske stamcelleegenskaber såsom opretholdelse af multipotens in vitro og selvfornyelse; og er tilhængere af plast i kultur 5,6. ADSC'er er af stor interesse for brugen i regenerativ medicin på grund af deres multipotens og evne til let at høstes i store mængder ved hjælp af ikke-invasive teknikker7. Aditogen differentiering af ADSC'er producerer celler, der funktionelt efterligner modne adipocytter, herunder lipidakkumulering, insulinstimuleret glukoseoptagelse, lipolyse og adipokinsekretion8. Deres lighed med modne adipocytter har ført til udbredt anvendelse af ADSC'er til fysiologisk undersøgelse af cellulære egenskaber og metabolisk funktion af adipocytter. Der er stigende beviser, der understøtter ideen om, at udviklingen af metabolisk dysfunktion og lidelser stammer fra celle- eller vævsniveau 9,10,11,12. Optimal ADSC-differentiering er nødvendig for tilstrækkelig fedtvævsudvidelse, korrekt adipocytfunktion og effektiv metabolisk regulering13.
Protokoller beskrevet i dette manuskript er enkle teknikker, der anvender standard laboratorieudstyr og grundlæggende reagenser. Manuskriptet beskriver først protokollen for isolering af primære ADSC'er fra frisk fedtvæv ved hjælp af mekanisk og enzymatisk fordøjelse. Dernæst beskrives protokollen for spredning og passaging af ADSC'er i stromalt medium. Endelig beskrives protokollen for adipogen differentiering af ADSC'er. Efter differentiering kan disse celler bruges til undersøgelser for bedre at forstå adipocytmetabolisme og dysfunktionsmekanismer. Protokollerne til bekræftelse af adipogen differentiering og lipiddråbedetektion ved anvendelse af olierød O og bor-dipyrromether (BODIPY) farvning er også beskrevet. Detaljerne i disse protokoller fokuserede på primære ADSC'er isoleret fra frisk omental fedtvæv af rhesus macaques. Vi og andre har brugt denne protokol til med succes at isolere ADSC'er fra rhesus macaque subkutane og omentale fedtvævsdepoter14,15. For den samme mængde væv, der anvendes, har vi observeret, at subkutant fedtvæv er mere tæt, hårdere og giver mindre celler fra fordøjelsen sammenlignet med omentalt fedtvæv. Denne protokol er også blevet brugt til at isolere ADSC'er fra humane fedtprøver16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 % trypan blue</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-ml microcentrifuge tube</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>707-FTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1838-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL plastic conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-465-232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>12561056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone-Water Soluble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, USDA-approved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer with cover slip</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DIAPHOT-TMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz</td>
			<td>Reliable Scientific</td>
			<td>Model 55 Rocking</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin (10 %)</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>8BUFF-FORM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformeldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell (RBC) lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 2 to 25 mL</td>
			<td>Costar Stripettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard humidified cell culture incubator, 37 &#176;C, 5 % CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-17AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells

Fedtvæv giver en rig og tilgængelig kilde til multipotente stamceller, som er i stand til selvfornyelse. Disse fedtafledte stamceller (ADSC'er) giver et konsistent ex vivo-cellulært system, der funktionelt ligner in vivo-adipocytter. Brug af ADSC'er i biomedicinsk forskning giver mulighed for cellulær undersøgelse af fedtvævets metaboliske regulering og funktion. ADSC-differentiering er nødvendig for tilstrækkelig adipocytudvidelse, og suboptimal differentiering er en vigtig mekanisme for fedtdysfunktion. Forståelse af ændringer i ADSC-differentiering er afgørende for at forstå udviklingen af metabolisk dysfunktion og sygdom. De protokoller, der er beskrevet i dette manuskript, vil, når de følges, give modne adipocytter, der kan bruges til flere in vitro funktionelle tests til vurdering af ADSC metabolisk funktion, herunder men ikke begrænset til assays, der måler glukoseoptagelse, lipolyse, lipogenese og sekretion. Rhesus macaques (Macaca mulatta) er fysiologisk, anatomisk og evolutionært ligner mennesker, og som sådan er deres væv og celler blevet brugt i vid udstrækning i biomedicinsk forskning og til udvikling af behandlinger. Her beskriver vi ADSC-isolering ved hjælp af frisk subkutant og omentalt fedtvæv opnået fra 4-9-årige rhesus macaques. Fedtvævsprøver fordøjes enzymatisk i collagenase efterfulgt af filtrering og centrifugering for at isolere ADSC'er fra den stromale vaskulære fraktion. Isolerede ADSC'er spredes i stromale medier efterfulgt af ca. 14-21 dages differentiering ved anvendelse af en cocktail af 0,5 μg / ml dexamethason, 0,5 mM isobutylmethylxanthin og 50 μM indomethacin i stromale medier. Modne adipocytter observeres ved ca. 14 dages differentiering. I dette manuskript beskriver vi protokoller for ADSC-isolering, spredning og differentiering in vitro. Selvom vi har fokuseret på ADSC'er fra rhesus macaque fedtvæv, kan disse protokoller bruges til fedtvæv opnået fra andre dyr med minimale justeringer.

ADSC'erne isoleret fra rhesus macaque fedtvævsprøver blev podet på dyrkningsplader og er vist i figur 1. På platingdagen er celler ikke-klæbende og flyder i kulturskålen som vist i figur 1A. Inden for 72 timer bliver ADSC'er 80% sammenflydende og er klar til adipocytdifferentiering (figur 1B). ADSC'er udviser stærke adipogene egenskaber efter kemisk induktion. Efter 14 dages differentiering kan modne adipocytter observeres vi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

I denne artikel beskriver vi isolering af rhesus macaque afledte fedtafledte stamceller (ADSC'er) ved hjælp af en enzymatisk vævsfordøjelsesprotokol. Dernæst beskriver vi ADSC-spredning, som omfatter celleløsning, tælling og plettering. Endelig beskrives ADSC-differentiering ved anvendelse af specifikke adipogene inducerende midler. Derudover beskriver vi farvningsteknikker for at bekræfte differentiering.

Isolering, spredning og differentiering af stamceller fra rhesus Macaque

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Fedtafledt stamcelleisolering og -spredning producerer et stort antal stamceller, der kan bruges til flere downstream-applikationer og eksperimentelle teknikker. En vigtig tilsigtet anvendelse til differentierede adipocytter i denne protokol er metaboliske assays såsom insulinstimuleret glukoseoptagelse, lipogenese og stimuleret lipolyse. Til at begynde med skal du skabe et sterilt arbejdsmiljø ved at desinficere biosikkerhedshætten og alle værktøjerne.Pipetter ca. 10 ml fem PBS-buffere i fire 100 millimeter cellekulturskåle. En fedtprøve på 50 g overføres til en af opvasken, og den vaskes fire gange ved sekventielt at overføre den til de andre skåle, der indeholder fem PBS. Overfør derefter det vaskede fedtvæv til en ren 100 millimeter kulturskål og hak det grundigt ved hjælp af saks eller steril tang.Overfør en til tre centimeter sektion af hakket væv til et 50 ml konisk rør indeholdende 13 ml collagenasebuffer. Skyl det resterende væv fra kulturskålen med to milliliter collagenasebuffer for at sikre et samlet volumen på 15 ml. Prøven blandes grundigt ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette og inkuberes røret ved 37 grader Celsius på en vippe i 30 til 60 minutter.For at neutralisere enzymaktiviteten tilsættes 10 ml ADSC-vækstmedium i røret efter inkubation og blandes godt med en pipette for at adskille eventuelle vævsaggregater. Overfør væskedelen til et nyt sterilt 50 ml konisk rør, hvilket efterlader det faste væv. Vævet vaskes tre gange med syv milliliter to PBS, og væsken overføres til det nye rør.Centrifuger derefter røret ved 500 gange G i fem minutter, og fjern forsigtigt så meget supernatant som muligt uden at forstyrre pelleten. Resuspender pelleten i en milliliter 1X røde blodlegemer eller RBC-lysisbuffer og inkuberer den ved stuetemperatur i 10 minutter. Vask derefter cellerne to gange ved at tilføje fem milliliter ADSC-vækstmedium til røret og centrifugere for at fjerne supernatanten.Efter den sidste vask suspenderes pelleten i to milliliter ADSC-vækstmedium og filtreres gennem en 70 mikron cellesi i et sterilt 50 ml konisk rør. Skyl silen med yderligere to milliliter af mediet og overfør fire milliliter af suspensionen til en steril 100 ml kulturskål. Skyl det koniske rør to gange med tre milliliter medium for at samle et samlet volumen på 10 ml i kulturskålen.Overhold de indsamlede celler under et omvendt mikroskop ved 10X forstørrelse for at kontrollere, om der er flydende celler. Inkuber cellerne i 24 timer i en kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 100% relativ fugtighed. For at sikre sterilitet af kulturmedierne skal du inkludere en plade med medier alene.Efter 24 timer skal du se cellerne under det omvendte mikroskop for at kontrollere for celleadhærens. Fjern og udskift mediet med varmt medium hver 48. time, indtil cellerne er 80 til 90% sammenflydende. Til spredning fjernes vækstmediet fra de sammenflydende ADSC-celler og vaskes to gange med to milliliter steril stuetemperatur PBS.Aspirer PBS og tilsæt to milliliter 0,25% trypsin EDTA i hver dyrkningsplade, der dækker hele pladens overfladeareal. Inkuber pladen i syv minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, og løsner derefter mekanisk de trypsiniserede celler ved kraftig pipettering. Tilsæt to milliliter ADSC-vækstmedium og bland forsigtigt cellerne.Overfør cellerne til et 50 ml konisk rør, skyl skålen med yderligere to milliliter medium for at sikre maksimal cellegendannelse fra pladen. Derefter centrifugeres røret ved 500 gange G i fem minutter ved stuetemperatur og dekanteres supernatanten for at opnå cellepellet. Resuspender cellepellet i fem til seks milliliter ADSC-vækstmedium pr. Million celler.Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og plade dem som beskrevet i tekstmanuskriptet. Når cellerne når 80 til 90% sammenløb, skal du opsuge vækstmediet og skylle cellerne med steril stuetemperatur PBS, og tilsæt derefter 10 ml ADSC-differentieringsmedium. Udskift mediet hver tredje dag i ca. 14 til 21 dage.Overhold cellerne for tilstedeværelsen af lipiddråber under det omvendte mikroskop ved 40X forstørrelse. Modne adipocytter observeres generelt efter 14 dage. På platingdagen var ADSC'erne ikke-klæbende og flød i kultur.Cellerne blev 80% sammenflydende efter 72 timer og var klar til adipocytdifferentiering. Efter 14 dages ADSC-differentiering udviste modne adipocytter stærke adipogene egenskaber, som blev observeret under 40X forstørrelse. På dag 14 blev celler farvet og fikseret med Oil Red O og BODIPY til lipiddråbevisualisering.Differentierede adipocytter kunne observeres under 20X forstørrelse. Når man forsøger denne protokol, er det vigtigt at huske, at et sterilt arbejdsmiljø er afgørende for sund isolation, tilstrækkelig ekspansion og effektiv differentiering af fedtafledte stamceller. Efter denne procedure kan disse celler bruges til flere metaboliske assays såsom glukoseoptagelse, lipogenese og lipolyse, som er et stort fokus for vores forskning.Denne teknik gør det muligt at undersøge, hvordan kronisk alkohol og SIV påvirker adipocytmetabolisk kapacitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolering og Differentiering af Stromale vaskulære celler til Beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manuel Isolering af Adipose-afledte stamceller fra humane Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolation, karakterisering og differentiering af Cardiac stamceller fra voksne mus hjerte

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Fedtvævsafledt stamcelleisolering og karakterisering

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Forfatter Spotlight: Isolering og identifikation af mesenkymale stamceller afledt af fedtvæv fra Sprague Dawley-rotter  

Isolering og identifikation af mesenkymale stamceller afledt af fedtvæv fra Sprague Dawley rotter

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...