Name: nanoparticle tracking analysis of gold nanoparticles in aqueous media through an inter-laboratory comparison
Uploaded: 2020-10-20T13:30:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison at JoVE.com

Forfatterne anerkender finansiel støtte fra H2020-finansieret projekt: ACEnano (tilskudsaftale nr. 720952). Dette arbejde blev også delvist støttet af Det Internationale Samarbejdsprogram for Forskning og Udvikling finansieret af Ministeriet for Handel, Industri og Energi i Korea (tilskudsnummer N053100009, "Horizon2020 Kor-EU collaborative R&BD on ACEnano Toolbox"), som muliggjorde deltagelse af de koreanske partnere i konsortiet af Horizon 2020 ACEnano Project.

Den her beskrevne metode blev anvendt til tredje runde af sammenligningerne mellem laboratorier.
1. Prøveforberedelse
<ol><li>Filtrer vand gennem et 0,02 μm sprøjtefilter. Vandfiltrering er nødvendig for at fjerne eventuelle kontamineringspartikler, før de bruges til prøvefortynding.</li>
	<li>For at analysere en frisklavet prøve fortyndes en prøve på 60 nm guldkolloidspredningsvolumen med en faktor på 50 i filtreret ultrapure vand. Den foreslåede koncentration til NTA-analyse er 1 x 107 – 1 x 109 partikler pr. mL.</li>
</ol>2. Udførelse af målingen
<ol><li>Tænd for systemet<ol>
<li>Tilslut NTA-instrumentet, sprøjtepumpen og computeren. Tænd for hardware og software. Den tilknyttede software (se Tabel over materialer) sikrer, at al hardwarekommunikation kører, og at der vises en udlæsning af en levende temperatur.</li>
		<li>Fjern lasermodulet fra NTA og brug en vævs- og trykluft helt af glasoverfladerne og de interne kanaler (LVFC) med lav volumenstrømscelle( LVFC), slanger og fluidiske porte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Grunding af slangen<ol>
<li>Skyl indløbsvæskerøret med ultrapure vand for at fjerne partikler og reducere sandsynligheden for luftbobler, der ville forstyrre målingerne. Til skylning placeres enden af indløbsrøret inde i instrumenthuset i en affaldsbeholder.</li>
		<li>Sæt en 1 mL sprøjte (uden nål) filtreret vand i Luer-porten, og skub ~900 μL væske gennem indløbsrøret så hurtigt som modtrykket tillader det. Lad sprøjten indeholde den resterende væske, der er fastgjort, for at forhindre, at der bliver syfoning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sprøjtepumpeslangeforbindelse<ol>
<li>LVFC samles på lasermodulet for at skabe prøvekammeret som set i figur 1. Fastgør udløbsslangen til LVFC'ens højre bagbord. BEMÆRK: Indløbs- og udløbsslangen er forskellig i diameter, idet indløbet er mindre i diameter end stikkontakten. Udskiftning af indløbsudtagsrørforbindelsen kan forårsage overtryk af flowcellen og lækage.</li>
		<li>Frakoble sprøjten fra indløbsslangen og ombyt til en ny sprøjte, der indeholder 1 mL filtreret vand, hvilket sikrer væske-til-væske kontakt. Tilslut indløbsslangen til venstre port på LVFC. Der indføres langsomt ~500 μL væske i prøvekammeret. Sørg for, at der ikke indføres luftbobler under pålæsningen. Den endelige slangekonfiguration er vist i figur 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig1v2.jpg"> Figur 1: Lav volumen Flow Cell samling monteret på laser modul. 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig02.jpg"> Figur 2: Konfiguration af celleslanger med lavt volumenflow. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<ol start="4"><li>Indlæsning af lasermodul og systemkontrol<ol>
<li>Sæt lasermodulet med det vandfyldte LVFC i instrumentet, og lås det på plads.</li>
		<li>Placer sprøjten i sprøjtepumpens holder og fastgør den. Initialiser kameraet ved at klikke på Start kamera i softwaregrænsefladen. Klik på Punktdiagram under fanen Hardware i grænsefladen for at flytte referencepositionen.</li>
		<li>Indstil kameraniveauet til 16, og juster fokus manuelt for at kontrollere fortyndingstiden for eventuelle partikler. Juster synsfeltets placering ved at venstreklik på hovedvisningsvinduet og bruge musen til at trække op og ned for at kontrollere, om der er partikler. Hvis der er mere end tre partikler i synsfeltet, indebærer dette et problem med vandrenhed eller rengøringsprocessen, og derfor skal rengøringsprocessen gentages, eller vandet skal udskiftes eller filtreres.</li>
		<li>Fjern lasermodulet fra instrumentet.</li>
		<li>Frakoble sprøjten fra indløbsrøret og udskift den kun med en sprøjte fuld af luft. Indfør langsomt luften i prøvekammeret for at fjerne væsken indeni. Fjern LVFC'en fra lasermodulet, og frakoble slangerne. Rengør glasoverfladerne på LVFC og optisk glas i lasermodulet med vand og tør med væv og trykluft. Tør slangen med trykluft. Sæt LVFC'en på lasermodulet igen, og tilslut slangen, klar til prøvebelastning. BEMÆRK: Dette trin er ikke altid påkrævet, men i dette tilfælde blev det tilføjet som en ekstra forholdsregel for yderligere at reducere eventuelle variationer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indlæser eksempel<ol>
<li>Gentag trin 2.2.2. Tilslut en sprøjte, der indeholder 1 mL af 60 nm guld nanopartikler spredning foretaget i trin 1.1 til Luer port. Der injiceres langsomt 750 μL af prøven i LVFC via indløbsrøret med lasermodulet set uden for instrumentet for at sikre, at der ikke indføres bobler.</li>
		<li>Indlæs lasermodulet tilbage til NTA-instrumentet, og initialiser kameraet ved at klikke på Start kamera i softwaregrænsefladen. Klik på Punktdiagram under fanen Hardware på grænsefladen for at flytte til referencefokuspositionen, og kontroller, at dette er indstillet korrekt for at give et klart billede af partiklerne.</li>
		<li>Kontroller, at synsfeltet er indstillet centralt med hensyn til laserstrålepositionen. Juster i overensstemmelse hermed ved at venstre klikke på de vigtigste visning vindue i softwaren og musen trække op og ned.</li>
		<li>Kør funktionen AutoSetup for automatisk at optimere fokus og kameraniveau for at sikre, at den optimale billedkvalitet opnås. BEMÆRK: De automatiske kamera- og fokusparametre giver mulighed for mere konsistens mellem de forskellige laboratorier, da dette er brugerintafhængigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksempelanalyse<ol>
<li>Opret et målescript i standardmåling, fanen SOP, for at få 5 gentagne videoer på 60 s under langsom (partikler skal passere over fra den ene side af skærmen til den anden i ca. 10 s) og konstant flow (Supplerende fil 1). BEMÆRK: Flow anbefales for at sikre en bedre repræsentation af den samlede prøve præsenteres til måling. Præcisionen og repeterbarheden af koncentrationsmålinger forbedres betydeligt, når prøven tilføres et langsomt flow for at sikre, at et større antal nye partikler strømmer gennem målezonen og analyseres under et eksperiment. Videolængden afhænger af profilfordelingen, og hvor variabel den er i løbet af analysetiden. 5 videoer af 60 s betragtes som en typisk målevarighed.</li>
		<li>Angiv eksperimentfilnavnet og -placeringen for dataene, og start kørslen. Analysen efter den skitserede procedure blev udført af de syv laboratorier i HORIZON 2020 ACEnano-projektet17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dataanalyse
BEMÆRK: Alle dataanalyser blev udført inden for v 3.4-softwaren (se Materialetabel),der anvendes ingen yderligere manuelle konverteringer eller beregninger. Partikelstørrelsesdataene præsenteres i rå form som en histogramfordeling og beregnes ud fra den målte ændring i partikelpositionen ved hjælp af Stokes-Einstein-ligningen. Softwaren bestemmer den gennemsnitlige afstand, der flyttes af hver partikel i x- og y-flyene. Denne værdi gør det muligt at bestemme partikelspredningskoefficienten (D), hvorfra partiklernes tilsvarende sfæriske hydrodynamiske radius, RH, kan beregnes, hvis prøvetemperaturen T og opløsningsmiddelviskositeten η er kendt. Prøvens temperatur registreres automatisk af NTA. Den standardprøveviskositet, der anvendes af softwaren, er til vand og er inkluderet i målescriptet vist ovenfor, selvom viskositet kan ændres af brugeren, når der anvendes forskellige prøvefortyndinger, enten før eller efter målingen er taget.
<ol><li>Indstil registreringstærsklen (DT) ved at trække i skyderen eller klikke på knapperne + og - i softwaren under Registreringstærskel, som er analyseparameteren for optimal sporing af de visualiserede partikler mellem 2 og 20. Sørg for, at den valgte DT-værdi identificerer og sporer så mange synlige partikler som muligt (markeret automatisk som røde kryds på softwarebilledskærmen).<ol>
<li>Som vejledning for fastsættelse af detektionstærsklen bør antallet af identificerede partikler i et billede ligge i området ca. 30-80, hvor højst 10 røde kors bør svare til steder, som observatøren ikke anses for at være partikler. Der bør ikke observeres mere end 5 blå kors (tegn på støj).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig03.jpg"> Figur 3: Observationer af tærskelværdier. En dårlig (venstre) og god (højre) detektion tærskel indstilling observation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<ol start="2"><li>Behandl automatisk partikelsporingsanalysevideoerne ved at trykke på knappen Proces i softwaren. Lad alle behandlingsparametrene være indstillet til automatisk og eksporter dataene som en resultatfil i .csv format med den fulde partikelstørrelsesfordeling og yderligere metadata, der beskriver måleopsætningen. Hvis du vil kontrollere målekvaliteten, skal du se under fanen Analyser i softwaren eller kontrollere .csv outputfil for at få advarsler eller advarsler. Et eksempel på PDF-resultatrapporten vises i Supplerende fil 2.
</li>
	<li>Læs resultaterne af tilstandsstørrelsen og den tilknyttede standardafvigelse fra PDF-rapporten. BEMÆRK: Resultaterne af tilstandsstørrelsen blev anvendt til at sammenligne de størrelser, der blev opnået blandt de syv laboratorier, og som er vist og diskuteret i afsnit 5.</li>
</ol>4. Rengøring og tørring
<ol><li>Efter brug skylles systemet grundigt med rent vand for at fjerne alle spor af prøve fra slangen og optiske overflader. Rengøringseffektiviteten kan overvåges ved observation af mængden af partikler i synsfeltet.</li>
	<li>Fjern lasermodulet fra NTA-instrumentet.</li>
	<li>Lad en sprøjte luft gennem systemet for at tømme slangen og LVFC.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxidative+toxicity+of+Ag+and+ZnO+nanoparticles+towards+the+aquatic+plant+Spirodela+punctuta+and+the+role+of+testing+media+parameters.">The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters.</a> Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).</li><li>Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformations+of+nanomaterials+in+the+environment.">Transformations of nanomaterials in the environment.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).</li><li>Auffan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+definition+of+inorganic+nanoparticles+from+an+environmental,+health+and+safety+perspective.">Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective.</a> Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).</li><li>Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+safe+are+nanomaterials.">How safe are nanomaterials.</a> Science. 350 (6259), 388-389 (2015).</li><li>Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+impacts+of+polyvinylpyrrolidone+(PVP)+capped+metal+oxide+nanoparticles+on+Daphnia+magna:+role+of+core+composition+and+acquired+corona.">Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona.</a> Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).</li><li>Hassell&#246;v, M. a. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology. , 211-266 (2009).</li><li>Hoet, P., Br&#252;ske-hohlfeld, I., Salata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+and+known+and+unknown+health+risks.">Nanoparticles and known and unknown health risks.</a> Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12 (2004).</li><li>Briffa, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+transformations+of+manufactured+nanomaterials+as+a+proposed+proxy+for+ageing.">Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing.</a> Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Walker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nano-particle+tracking+analysis.">Improved nano-particle tracking analysis.</a> Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605 (2012).</li><li>Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical Available from: <a target="_blank" href="https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx">https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx</a> (2019)</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Roebben, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+and+surface+charge+measurements+on+nanoparticles+prior+to+biological+impact+assessment.">Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment.</a> Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675 (2011).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano Available from: <a target="_blank" href="https://cordis.europa.ue/project/id/720952">https://cordis.europa.ue/project/id/720952</a> (2019)</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. 1360, (1990).</li></ol>

Forfatteren Jo Sullivan, Agnieszka Siupa, Pauline Carnell-Morris og Michele Carboni er medarbejdere hos Malvern Panalytical Ltd. der fremstiller instrumenter, der anvendes i denne artikel.

De inkonsekvente resultater fra runde 1 ILC fremhævede behovet for instrumentsundhedskontrol for ældre systemer samt udviklingen af en mere detaljeret SOP, behovet for praktisk træning og en bedre forståelse af måle- og analyseindstillinger for at sikre mere ensartede resultater på tværs af de forskellige laboratorier. Faktisk fandt Hole et al., at manglen på fælles retningslinjer for, hvordan man bruger et NTA-system og forbereder prøver, resulterede i variabilitet på tværs af laboratorier selv for relativt monoperserede prøver16. Derfor deltog alle ILC-deltagere i en træningsworkshop, der dækkede de bedste praksis for systemets drifts- og måleforhold samt rengørings- og vedligeholdelsesvejledning til det specifikke NTA-instrument. Alle deltagere udførte også målinger på det samme instrument i deres egne laboratorier til de efterfølgende ILC-runder. Proceduren involverede først en runde, der testede systemet lokalt i hvert laboratorium ved at køre en ILC på latex standardprøver (ILC Runde 2), før den blev brugt af partnerne til at gentage guldmålingerne (ILC Runde 3). Formålet med at måle disse guldprøver ved hjælp af NTA var at skabe tillid og klarhed i nanomateriale risikovurderingsmetoder og -praksis, der er nødvendige for at påvirke nanosikkerhedsvejledningsprotokoller.
NTA er en teknik, der kan måle partiklernes hydrodynamiske sfæriske tilsvarende diameter og kan bruges til partikel ved partikel, realtids visuel analyse af polydisperserede systemer fra 10 nm - 50 nm til ca. 1000 nm i størrelse (afhængigt af prøveegenskaberne og instrumentkonfigurationen). Minimal prøveforberedelse er påkrævet. På trods af minimal prøveforberedelse er dette trin kritisk for protokollen, og der skal udvises stor omhu ved fortynding af en prøve og valg af fortyndingsmiddel. Form kan være en begrænsende faktor med hensyn til NTA, da der opnås sfæriske målinger af tilsvarende størrelse, og ikke-sfæriske partikler vil have en mindre nøjagtig størrelsesværdi.
For NTA-teknologi kan der altid forventes en vis resultatvariation, da der kun observeres en repræsentativ stikprøve fra hele prøven. Uanset hvad opfylder alle resultater ISO 19430-standarden for partikelstørrelse. Den optimale koncentration, der skal leveres, er typisk omkring10 8 partikler/ml inden for en analysetid på 30-60 sekunder. For prøver med lavere partikelkoncentrationer kræves der længere analysetider for at sikre reproducerbare resultater. For prøver, der indeholder en koncentration af partikler på over 109 partikler/mL, er der større sandsynlighed for sporingsproblemer, og prøverne skal fortyndes ned til et passende område til NTA-måling.
Samlet set viser resultaterne fra 3rd Round ILC god reproducerbarhed af guld nanopartikelmålinger med NTA med øget nøjagtighed og repeterbarhed. Alle NTA-målinger blev udført ved hjælp af de automatiske kameraniveau- og fokusindstillinger for at justere billedet, som valgt af funktionen Automatisk konfiguration i softwaren. Kameraniveauet, der er indstillet af softwaren, var meget konsistent, idet et kameraniveau på 10 eller 11 blev indstillet i alle tilfælde, hvilket viser, at jo mere automatisering en proces inkluderer, jo mere konsistens opnås. Størrelsesresultaterne var sammenlignelige med dem, som fabrikanten opnåede ved hjælp af TEM, hvilket tyder på, at resultaterne kunne reproduceres, men der kan forventes minimale forskelle fra forskellige teknikker, da TEM ikke bestemmer hydrodynamisk diameter. Den betydelige forbedring af resultaternes konsistens viser vigtigheden og fordelene ved instrumentvedligeholdelse, detaljerede programprogrammer, opdateringer af bedste praksis, brugerkendskab og anvendt måleautomatisering for NTA. Afslutningsvis godkendte ILC denne specifikke NTA-SOP og indførte derfor tillid og klarhed i denne specifikke nanomaterialerisikovurderingsmetode.

Nanomaterialer (NMs) kan variere i både fysiske og kemiske egenskaber, der igen påvirker deres adfærd, stabilitet ogtoksicitet 1,2,3,4,5. En af de største vanskeligheder, når man udvikler en grundig forståelse af NM-egenskaber, farer og adfærd, er evnen til at opnå reproducerbare oplysninger om fysiske og kemiske nanomaterialer. Eksempler på sådanne fysiske egenskaber omfatter partikelstørrelse og størrelsesfordeling6,7,8. Det er vigtige parametre, da de er et centralt aspekt af Europa-Kommissionens (EF) definition af begrebet "nano"9.
Opnåelse af præcise partikelstørrelsesmålinger er også afgørende for mange forskellige industrielle og forskningsmæssige anvendelser og processer ud over at forstå skæbnen og toksicitetseffekterne af NMs6,10. Det er vigtigt at have veletablerede metoder, der er i stand til at måle nøjagtigt, pålideligt og reproducerbart størrelsen af NMs. Desuden bør de indberettede oplysninger give en dyb forståelse af den anvendte teknik, f.eks. For at måle størrelsen kan der anvendes en række teknikker, herunder elektronmikroskopi (EM), dynamisk lysspredning (DLS), enkeltpartikelinduktivt koblet plasmamassespektrometri (spICP-MS), differential centrifugal sedimentering (DCS), scanning af sondemikroskopi (SPM), lillevinkel røntgenspredning (SAXS) og nanopartikelsporingsanalyse (NTA).
NTA er en relativt ny teknologi, som har været langt fremme i de senere år, og som har vist sig at måle den hydrodynamiske diameter af sfæriske NMs pålideligt i komplekse vandige medier som f.eks. Den hydrodynamiske diameter er »størrelsen af en hypotetisk hård kugle, der diffunderer på samme måde som den partikel, der måles«11; i praksis og i vandige medier beskriver dette en diameter, der er større end selve partikelens, som også omfatter et lag af molekyler (for det meste vand), der holdes på overfladen af partikel af svage elektrostatiske kræfter. Den hydrodynamiske diameter af en partikel vil variere i forskellige medier, bliver mindre som den ioniske styrke af de medier, hvor det måles bliver højere.
Et yderligere vigtigt træk ved NTA-teknikken er, at den gør det muligt for analytikeren at opnå talvægtede størrelsesmålinger, som er nødvendige i forbindelse med EF's nanomaterialedefinition. Høj opløsning, partikel-for-partikel analyse gør denne teknik mindre tilbøjelige til interferens forårsaget af agglomerater eller større partikler, når de findes i en heterogen testprøve med en høj partikel gennemløb10,12.
Måleproceduren består i at forberede en passende suspension af prøven, som ofte kræver prøvefortynding, efterfulgt af videooptagelse af partiklernes Brownian-bevægelsesadfærd og videoanalyse. Fra prøvekammeret passeres en laserstråle, og suspensionspartiklerne i laserstrålens sti spreder lys, der fører til deres visualisering ved hjælp af et optisk mikroskop med et monteret kamera. Kameraet optager en videofil af det spredte laserlys fra partiklerne, der bevæger sig under Brownian-bevægelse. Mange partikler kan spores individuelt for at bestemme deres diffusionskoefficienter, og deres hydrodynamiske diametre kan beregnes ved hjælp af Stokes-Einstein-ligningen: d = kT/3πηD, hvor d er den hydrodynamiske diameter, k er Boltzmann-konstanten, T er temperaturen, η er viskositeten, og D er diffusionskoefficienten10. NTA kan også bruges til at spore aggregeringsadfærden af partikler, der generelt er kolloidt ustabile (partiklerne skal dog være kolloidt stabile over måletidsskalaen)13,14. NTA er en absolut metode, og der kræves ingen systemkalibrering på det instrument, der anvendes i dette arbejde. Hvis brugerne ønsker at kontrollere systemets ydeevne dette kan nemt gøres ved at måle størrelse standard materialer så ofte som ønsket.
NTA-instrumentet er let at betjene med hurtig analysetid (under 10 min pr. prøve). Ved målinger af høj kvalitet med god datagennemelighed og reproducerbarhed bør en række faktorer tages i betragtning både i prøveforberedelsen og i instrumentdriften. Hvis sådanne faktorer ikke overvejes nøje, kan målinger af det samme materiale på tværs af forskellige laboratorier og operatører blive udsat for ukendte eller dårligt kvantificerede usikkerheder. Under NP karakterisering, ved hjælp af bedste praksis in-house udviklede SOP'er ikke altid garantere overensstemmelse med andre laboratorier, som det fremgår af Roebben et al. for DLS teknik15.
Faktisk afslørede en tidlig (første runde) NTA ILC mellem forskellige laboratorier, brugere og instrumenter inkonsekvente resultater. Et af hovedproblemerne var brugen af forskellige ældre ældre ældre instrumenter, som ikke havde haft regelmæssig service eller kalibreringskontrol, samt forskelle i metodefortolkning. En NTA ILC-undersøgelse foretaget af Hole et al. viste, at med manglen på fælles retningslinjer for, hvordan man bruger et system og forbereder prøver, kan variationen på tværs af laboratorier være stor, selv for relativt monodisperserede prøver16. Dette sammen med resultaterne fra første runde af ILC understreger behovet for god instrumentvedligeholdelse samt metodetræning og veludviklede standardprocedurer. Sidstnævnte fungerer som et effektivt redskab til at beskrive og dokumentere overholdelse af god praksis. Hvis det er godt detaljeret, kan standardprocedurer tilbyde klarhed, forklaring, forståelse, standardisering og kvalitetssikring.
Anbefalingen om at vedtage en ILC-undersøgelse er derfor ideel til både udvikling og afprøvning af protokoller16. ILC-øvelsen handlede for at validere denne specifikke NTA-SOP og indførte derfor tillid og klarhed i denne specifikke nanomaterialerisikovurderingsmetode. Det involverede tre runder. Runde 1 analyserede 60 nm guld nanopartikler på hver deltagers egne instrumenter før træning. Runde 2 involverede analyse af 100 nm latex ved hjælp af et nyt instrument med fælles konfiguration som en simpel test for at fastslå, at instrumentet blev oprettet korrekt, og brugerne havde et godt kendskab til, hvordan instrumentet skulle bruges. Runde 3 omfattede analyse af 60 nm guld nanopartikler på det nye instrument med fælles konfiguration, efter træning. Deltagerne i ILC kom fra syv forskellige laboratorier, alle konsortiemedlemmer af Horizon 2020 ACEnano-projektet17.
Formålet med denne artikel er at diskutere metoden og resultaterne fra en tredje runde af benchmarking for NTA-teknologi, hvor 60 nm guld NPs blev re-analyseret af syv partnere efter detaljeret uddannelse og SOP udvikling. Der vil også blive foretaget en sammenligning og henvisning til de resultater, der er opnået i første runde af ILC. Alle analyser fra runde 3 af ILC blev udført ved hjælp af det samme instrument (se Materialetabel)af identisk konfiguration leveret med en 405 nm laser og et højfølsomt SCMOS-kamera. Benchmarking vurderer teknologiens ydeevne på stikprøver og fører derfor til udvikling af protokoller om bedste praksis. Denne artikel deler og gør således også NTA-metoden for det instrument, der anvendes i denne ILC, tilgængelig for det videnskabelige samfund, da den er blevet harmoniseret ved at gennemføre og evaluere ILC'erne i overensstemmelse med internationale standarder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 nm gold colloid dispersion</td>
			<td>BBI Solutions OEM Ltd.</td>
			<td>Product EM. GC60, Batch number 024650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.02 &#181;m syringe filter - Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA68092102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical Ltd.</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA Software v3.4</td>
			<td>Malvern Panalytical Ltd.</td>
			<td>v3.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1&#160;mL, graduated, 0.01&#160;mL, sterile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z230723</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis of gold nanoparticles in aqueous media through an inter-laboratory comparison

Inden for nanoteknologi spiller analytisk karakterisering en afgørende rolle i forståelsen af nanomaterialers (NMs) adfærd og toksicitet. Karakterisering skal være grundig, og den valgte teknik skal være velegnet til den egenskab, der skal bestemmes, det materiale, der analyseres, og det medium, hvor det er til stede. Desuden skal instrumentets funktion og metode være veludviklet og klart forstået af brugeren for at undgå dataindsamlingsfejl. Eventuelle uoverensstemmelser i den anvendte metode eller procedure kan føre til forskelle og dårlig reproducerbarhed af de opnåede data. Dette papir har til formål at præcisere metoden til måling af den hydrodynamiske diameter af guld nanopartikler ved hjælp af Nanopartikel Tracking Analysis (NTA). Denne undersøgelse blev udført som en sammenligning mellem laboratorier (ILC) mellem syv forskellige laboratorier for at validere standardprocedurens ydeevne og reproducerbarhed. Resultaterne af denne ILC-undersøgelse afslører vigtigheden og fordelene ved detaljerede standardprocedurer, opdateringer af bedste praksis, brugerkendskab og målingsautomatisering.

ILC-runde 1-resultaterne ved hjælp af forskellige NTA-instrumentkonfigurationer er vist i figur 4. Med undtagelse af Lab 6 var repeterbarheden mellem de 5 capture-gentagelser god, men flere laboratorier registrerede en tilstandsstørrelse, der var højere end forventet. Lab 6 resultater viste dårlig repeterbarhed og en meget højere tilstand størrelse målt. Efter undersøgelsen blev det konstateret, at de systemer, der rapporterede de største størrelsesvariationer, enten ikke blev vedligeholdt som anbefalet, eller analysen blev påvirket af inkonsekvens i prøveforberedelsen, hvorved fortyndingstrinnet kan skabe variation forårsaget af forskelligt rørudstyr, brugerdrift og teknik og/eller måling, herunder at flowcellen ikke er ren, at det forkerte kameraniveau anvendes, at billedet ikke fokuseres korrekt, og at analysedetekteringstærsklen indstilles forkert.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig4v2.jpg"> Figur 4: Resultater af ILC-runde 1-tilstandsstørrelse. Mode størrelse resultater fra alle NTA benchmarking partnere for Runde 1 60 nm guld nanopartikel spredning udført på forskellige NTA instrumenter (som forkortet i x aksen).
NTA-resultatnøjagtigheden fra runde 3 blev forbedret af alle de laboratorier, der implementerede de samme SOP- og instrumentindstillinger. De resultater af tilstandsstørrelsen, der er opnået for denne ILC-runde 3, kan ses i figur 5. Den gennemsnitlige tilstand på tværs af alle laboratorier var 62,02 ± 1,97 nm. Alle målte resultater fra runde 3 var mere konsistente end resultaterne i første fase, idet resultaterne lå et godt stykke under 10 % af den gennemsnitlige størrelse på 60,5 nm for partiet som angivet af fabrikanten. Variationskoefficienten for de guldprøver, som fabrikanten havde angivet, var ≤8%.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig5v2.jpg"> Figur 5: Resultater af ILC-runde 3-tilstandsstørrelse. Mode størrelse resultater fra alle NTA benchmarking partnere for 60 nm guld ILC Runde 3 analyseret på samme NTA instrument. Den gennemsnitlige tilstand på tværs af alle laboratorier var 62,02 ± 1,97 nm.
For at kontrollere partikelstørrelsen, som leveret af producenten, blev et lille antal (N = 82) partikler analyseret af Transmission Electron Microscopy (TEM). Ca. 10 μl af den ufortyndede spredning blev dråbestøbt på et kulstofbelagt Cu TEM-gitter og tørret i luften før billeddannelse i en analytisk TEM ved 200 kV. Billeder som Supplerende Figur 1 blev taget fra områder med minimal partikeloverlapning og analyseret ved hjælp af en halvautomatisk billedanalyseproces. En automatisk skelsættende metode blev anvendt på separate partikler og artefakter i denne proces blev udelukket såvel som på kantpartikler18. Middeldiameteren blev beregnet enten som gennemsnit fra den større og mindre akse (61 ± 7 nm) eller som en omdannelse fra det målte område (62 ± 6 nm) under forudsætning af sfæriske partikler. Partikler synes at være for det meste sfæriske med et gennemsnitligt højde-bredde-forhold på 1,1. TEM-resultaterne viser en lidt højere diameter end producentens værdi (60,5 nm), men ligger inden for toleranceniveauet. Derudover er der en meget god aftale med NTA afledte værdi af hydrodynamiske diameter.
Supplerende figur 1: TEM billede af 60 nm Guld Nanopartikler. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741supfig01.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade dette tal.</a>
Supplerende fil 1: Målescript. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/Measurement_script.docx" target="_blank">Klik her for at hente denne fil.</a>
Supplerende fil 2: Eksempel på PDF-resultatrapport. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/PDF_results_report.pdf" target="_blank">Klik her for at hente denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison at JoVE.com

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

Den her beskrevne protokol har til formål at måle den hydrodynamiske diameter af sfæriske nanopartikler, mere specifikt guld nanopartikler, i vandige medier ved hjælp af Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Sidstnævnte indebærer sporing af bevægelsen af partikler på grund af Brownian bevægelse og gennemføre Stokes-Einstein ligning for at opnå den hydrodynamiske diameter.

Nanopartikelsporingsanalyse af guldnanopartikler i vandige medier gennem en sammenligning mellem laboratorier

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

En simpel metode til størrelse Kontrolleret Syntese af stabile Oligomere Klynger af guld nanopartikler under omgivende betingelser

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

En optimeret protokollen om Effektiv Radioaktiv mærkning af Gold Nanopartikler ved hjælp af en<sup&gt; 125</sup&gt; I-mærket Azide prostetiske gruppe

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Væske-celle transmissions elektronmikroskopi til sporing samlesæt af nanopartikler

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Hurtig Nanoprobe Signal forstærkning af In Situ guld nanopartikel syntese

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Heterogeneous Removal of Water-Soluble Ruthenium Olefin Metathesis Catalyst from Aqueous Media Via Host-Guest Interaction

Heterogene fjernelse af vandopløselige Ruthenium Olefin Metathesis katalysator fra vandige medier Via vært-gæst interaktion

A highly efficient transition metal catalyst removal method is developed. The water-soluble catalyst contains a newly-designed NHC ligand for the catalyst ...

Synthesis and Characterization of Amphiphilic Gold Nanoparticles

Syntese og karakterisering af Amphiphilic guld nanopartikler

Gold nanoparticles covered with a mixture of 1-octanethiol (OT) and 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) have been extensively studied because of ...

Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection

Guld nanopartikel modificerede carbon fiber Mikroelektroderne til forbedret Neuro kemisk detektion

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Syntese af Aptamer-PEI-g-PEG Modificeret Guld Nanopartikler Fyldt med Doxorubicin for målrettet drug delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

Forberedelse af nanopartikler til ToF-SIMS- og XPS-analyse

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...