Name: nanoparticle tracking analysis of gold nanoparticles in aqueous media through an inter-laboratory comparison
Uploaded: 2020-10-20T13:30:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison at JoVE.com

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del progetto finanziato dall'H2020: ACEnano (Accordo di sovvenzione n. 720952). Questo lavoro è stato anche parzialmente supportato dal Programma internazionale di ricerca e sviluppo cooperativo finanziato dal Ministero del Commercio, dell'Industria e dell'Energia della Corea (numero di sovvenzione N053100009, "Horizon2020 Kor-EU collaborative R&BD on ACEnano Toolbox") che ha permesso la partecipazione dei partner coreani al consorzio di Horizon 2020 ACEnano Project.

La metodologia qui descritta è stata utilizzata per il terzo ciclo di confronti tra laboratori.
1. Preparazione del campione
<ol><li>Filtrare l'acqua attraverso un filtro siringa da 0,02 μm. La filtrazione dell'acqua è necessaria per rimuovere eventuali particelle di contaminazione prima di utilizzarla per la diluizione del campione.</li>
	<li>Per analizzare un campione appena preparato, diluire un campione di dispersione colloide d'oro di 60 nm volumetricamente di un fattore 50 in acqua ultrapura filtrata. La concentrazione suggerita per l'analisi NTA è di 1 x10 7 – 1 x 109 particelle per mL.</li>
</ol>2. Esecuzione della misurazione
<ol><li>Accensione del sistema<ol>
<li>Collegare lo strumento NTA, la pompa per siringhe e il computer. Accendere l'hardware e il software. Il software associato (vedere Table of Materials) garantisce l'esecuzione di tutte le comunicazioni hardware e la visualizzazione di una lettura della temperatura in tempo vivo.</li>
		<li>Rimuovere il modulo laser dall'NTA e utilizzare un tessuto e aria compressa asciugare completamente le superfici di vetro e i canali interni, i tubi e le porte fluidiche della cella a basso volume (LVFC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adescamento del tubo<ol>
<li>Risciacquare i tubi fluidici di ingresso con acqua ultrapura per rimuovere eventuali particelle e ridurre la probabilità di bolle d'aria che interferiscano con le misurazioni. Per il risciacquo, l'estremità del tubo di ingresso all'interno dell'involucro dello strumento viene posta in un contenitore di rifiuti.</li>
		<li>Inserire una siringa da 1 ml (senza ago) di acqua filtrata nella porta Luer e spingere ~ 900 μL di liquido attraverso i tubi di ingresso il più velocemente possibile dalla controtezione. Lasciare la siringa contenente il liquido rimanente attaccato per evitare qualsiasi sifone.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collegamento tubi pompa siringa<ol>
<li>Assemblate l'LVFC sul modulo laser per creare la camera campione come si vede nella figura 1. Collegare il tubo di uscita alla porta laterale destra della LVFC. NOTA: I tubi di ingresso e di uscita sono di diametro diverso, con l'ingresso di diametro inferiore rispetto all'uscita. Lo scambio della connessione del tubo di uscita di ingresso può causare una pressione sulla cella di flusso e perdite.</li>
		<li>Scollegare la siringa dai tubi di ingresso e scambiare con una nuova siringa contenente 1 ml di acqua filtrata, garantendo un contatto liquido-liquido. Collegare il tubo di ingresso alla porta sinistra dell'LVFC. Introdurre lentamente ~500 μL di liquido nella camera campione. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria durante il caricamento. La configurazione finale dei tubi è illustrata nella figura 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig1v2.jpg"> Figura 1: Assemblaggio a celle a flusso a basso volume montato su modulo laser. 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig02.jpg"> Figura 2: Configurazione dei tubi a celle a flusso a basso volume. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="4"><li>Caricamento del modulo laser e controllo del sistema<ol>
<li>Inserire il modulo laser con l'LVFC riempito d'acqua nello strumento e bloccarlo in posizione.</li>
		<li>Posizionare la siringa nella culla della pompa della siringa e fissare. Inizializzare la fotocamera facendo clic su Avvia fotocamera nell'interfaccia software. Nella scheda Hardware dell'interfaccia fare clic su Dispersione per spostare la posizione di riferimento.</li>
		<li>Impostare il livello della fotocamera su 16 e regolare manualmente la messa a fuoco per controllare il diluente per eventuali particelle. Regolare la posizione del campo visivo facendo clic a sinistra sulla finestra di visualizzazione principale e utilizzando il mouse per trascinare su e giù per verificare la presenza di particelle. Se ci sono più di tre particelle nel campo visivo, ciò implica un problema con la purezza dell'acqua o il processo di pulizia e, pertanto, il processo di pulizia deve essere ripetuto o l'acqua deve essere sostituita o filtrata.</li>
		<li>Rimuovere il modulo laser dallo strumento.</li>
		<li>Scollegare la siringa dal tubo di ingresso e sostituirla con una siringa piena solo d'aria. Introdurre lentamente l'aria nella camera campione per rimuovere il liquido all'interno. Rimuovere l'LVFC dal modulo laser e scollegare i tubi. Pulire le superfici in vetro della LVFC e del vetro ottico del modulo laser con acqua e asciugare con un tessuto e aria compressa. Asciugare i tubi con aria compressa. Riassemblare l'LVFC sul modulo laser e collegare il tubo, pronto per il caricamento del campione. NOTA: Questo passaggio non è sempre richiesto, tuttavia, in questo caso è stato aggiunto come precauzione aggiuntiva per ridurre ulteriormente ogni possibile variazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esempio di caricamento<ol>
<li>Ripetere il passaggio 2.2.2. Collegare una siringa contenente 1 ml della dispersione di nanoparticelle d'oro da 60 nm effettuata nel passaggio 1.1 alla porta Luer. Iniettare lentamente 750 μL del campione nella LVFC tramite il tubo di ingresso con il modulo laser visualizzato all'esterno dello strumento per garantire che non vengano introdotte bolle.</li>
		<li>Caricare il modulo laser sullo strumento NTA e inizializzare la fotocamera facendo clic su Avvia fotocamera nell'interfaccia software. Nella scheda Hardware dell'interfaccia fare clic su Dispersione per passare alla posizione di messa a fuoco di riferimento, verificare che sia impostata correttamente per fornire un'immagine chiara delle particelle.</li>
		<li>Verificare che il campo visivo sia impostato centralmente rispetto alla posizione del raggio laser. Regola di conseguenza facendo clic a sinistra sulla finestra di visualizzazione principale del software e trascinando verso l'alto e verso il basso.</li>
		<li>Eseguire la funzione AutoSetup per ottimizzare automaticamente la messa a fuoco e il livello della fotocamera garantendo il massimo della qualità ottimale dell'immagine. NOTA: i parametri automatici della fotocamera e della messa a fuoco consentono una maggiore coerenza tra i diversi laboratori poiché questo è indipendente dall'utente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi campiontica<ol>
<li>Creare uno script di misurazione nella misurazione standard, scheda SOP, per ottenere 5 video ripetuti di 60 s sotto lento (le particelle devono passare da un lato all'altro dello schermo in circa 10 s) e flusso costante (File supplementare 1). NOTA: Il flusso è raccomandato per garantire una migliore rappresentazione del campione complessivo per la misurazione. La precisione e la ripetibilità delle misurazioni della concentrazione sono significativamente migliorate quando un flusso lento viene impartito sul campione per garantire che un maggior numero di nuove particelle fluisco attraverso la zona di misurazione e vengano analizzate durante un esperimento. La lunghezza del video dipende dalla distribuzione del profilo e dalla sua variabilità nel tempo di analisi. 5 video di 60 s sono considerati come una durata di misurazione tipica.</li>
		<li>Impostare il nome e il percorso del file di esperimento per i dati e avviare l'esecuzione. L'analisi a seguito della procedura delineata è stata effettuata dai sette laboratori del progetto Horizon 2020 ACEnano17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analisi dei dati
NOTA: Tutte le analisi dei dati sono state fatte all'interno del software v 3.4 (vedi Tabella dei materiali),non vengono utilizzate conversioni o calcoli manuali aggiuntivi. I dati di dimensionamento delle particelle sono presentati in forma grezza come distribuzione dell'istogramma e sono calcolati dal cambiamento misurato in posizione della particella usando l'equazione di Stokes-Einstein. Il software determina la distanza media spostata da ogni particella nei piani x e y. Questo valore consente di determinare il coefficiente di diffusione delle particelle (D) da cui, se sono noti la temperatura del campione T e la viscosità del solvente η, è possibile calcolare il raggio idrodinamico sferico equivalente, RH, delle particelle. La temperatura del campione viene registrata automaticamente dall'NTA. La viscosità del campione predefinita utilizzata dal software è per l'acqua ed è inclusa nello script di misurazione mostrato sopra, anche se la viscosità può essere modificata dall'utente quando vengono utilizzati diversi diluenti del campione, prima o dopo la misurazione.
<ol><li>Impostare la soglia di rilevamento (DT) trascinando la barra di scorrimento o facendo clic sui pulsanti + e - nel software in Soglia di rilevamento, che è il parametro di analisi per il tracciamento ottimale delle particelle visualizzato, compreso tra 2 e 20. Assicurarsi che il valore DT scelto identifichi e monitori il maggior numero possibile di particelle visibili (contrassegnate automaticamente come croci rosse sullo schermo dell'immagine del software).<ol>
<li>Come guida per la fissazione della soglia di rivelazione, il numero di particelle identificate in un'immagine dovrebbe essere dell'intervallo di circa 30-80, dove non più di 10 croci rosse dovrebbero corrispondere a siti non considerati particelle dall'osservatore. Non dovrebbero essere osservate più di 5 croci blu (indicative del rumore).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig03.jpg"> Figura 3: Osservazioni relative all'impostazione della soglia. Osservazione dell'impostazione della soglia di rilevamento cattiva (sinistra) e buona (destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"><li>Elabora automaticamente i video di analisi del tracciamento delle particelle premendo il pulsante Processo nel software. Lasciare tutti i parametri di elaborazione impostati su automatico ed esportare i dati come file dei risultati .csv formato con la distribuzione completa delle dimensioni delle particelle e metadati aggiuntivi che descrivono l'impostazione della misurazione. Per verificare la qualità della misurazione, esaminare la scheda Analizza nel software o controllare il file di output .csv per eventuali avvisi o messaggi di avviso. Un esempio del rapporto sui risultati PDF è mostrato nel file complementare 2.
</li>
	<li>Leggere i risultati delle dimensioni della modalità e la deviazione standard associata dal report PDF. NOTA: I risultati delle dimensioni delle modalità sono stati utilizzati per confrontare le dimensioni ottenute tra i sette laboratori e sono mostrati e discussi nella sezione 5.</li>
</ol>4. Pulizia e asciugatura
<ol><li>Dopo l'uso, sciacquare accuratamente il sistema con acqua pulita per rimuovere tutte le tracce di campione dai tubi e dalle superfici ottiche. L'efficacia della pulizia può essere monitorata dall'osservazione della quantità di particelle nel campo visivo.</li>
	<li>Rimuovere il modulo laser dallo strumento NTA.</li>
	<li>Caricare una siringa d'aria attraverso il sistema per svuotare i tubi e l'LVFC.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxidative+toxicity+of+Ag+and+ZnO+nanoparticles+towards+the+aquatic+plant+Spirodela+punctuta+and+the+role+of+testing+media+parameters.">The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters.</a> Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).</li><li>Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformations+of+nanomaterials+in+the+environment.">Transformations of nanomaterials in the environment.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).</li><li>Auffan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+definition+of+inorganic+nanoparticles+from+an+environmental,+health+and+safety+perspective.">Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective.</a> Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).</li><li>Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+safe+are+nanomaterials.">How safe are nanomaterials.</a> Science. 350 (6259), 388-389 (2015).</li><li>Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+impacts+of+polyvinylpyrrolidone+(PVP)+capped+metal+oxide+nanoparticles+on+Daphnia+magna:+role+of+core+composition+and+acquired+corona.">Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona.</a> Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).</li><li>Hassell&#246;v, M. a. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology. , 211-266 (2009).</li><li>Hoet, P., Br&#252;ske-hohlfeld, I., Salata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+and+known+and+unknown+health+risks.">Nanoparticles and known and unknown health risks.</a> Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12 (2004).</li><li>Briffa, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+transformations+of+manufactured+nanomaterials+as+a+proposed+proxy+for+ageing.">Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing.</a> Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Walker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nano-particle+tracking+analysis.">Improved nano-particle tracking analysis.</a> Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605 (2012).</li><li>Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical Available from: <a target="_blank" href="https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx">https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx</a> (2019)</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Roebben, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+and+surface+charge+measurements+on+nanoparticles+prior+to+biological+impact+assessment.">Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment.</a> Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675 (2011).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano Available from: <a target="_blank" href="https://cordis.europa.ue/project/id/720952">https://cordis.europa.ue/project/id/720952</a> (2019)</li><li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. 1360, (1990).</li></ol>

L'autore Jo Sullivan, Agnieszka Siupa, Pauline Carnell-Morris e Michele Carboni sono dipendenti di Malvern Panalytical Ltd. che produce strumenti utilizzati in questo articolo.

I risultati incoerenti ottenuti dall'ILC round 1 hanno evidenziato la necessità di controlli dello stato di salute degli strumenti per i sistemi più vecchi, nonché lo sviluppo di un SOP più dettagliato, la necessità di una formazione pratica e una migliore comprensione delle impostazioni di misurazione e analisi in modo da garantire risultati più coerenti nei diversi laboratori. Infatti, Hole et al. Pertanto, tutti i partecipanti all'ILC hanno partecipato a un workshop di formazione riguardante le migliori pratiche per il funzionamento del sistema e le condizioni di misurazione, nonché le linee guida per la pulizia e la manutenzione per lo specifico strumento NTA. Tutti i partecipanti hanno anche eseguito misurazioni sullo stesso strumento nei propri laboratori per i successivi round ILC. La procedura ha riguardato per la prima volta un round che ha testato il sistema localmente in ogni laboratorio eseguendo un ILC su campioni standard in lattice (ILC Round 2), prima di essere utilizzato dai partner per ripetere le misurazioni dell'oro (ILC Round 3). L'obiettivo della misurazione di questi campioni d'oro mediante l'NTA era quello di introdurre fiducia e chiarezza nei metodi e nelle pratiche di valutazione del rischio dei nanomateriali necessari per influire sui protocolli di guida sulla nanosicurezza.
NTA è una tecnica in grado di misurare il diametro sferico equivalente idrodinamico delle particelle e può essere utilizzata per particelle per particella, analisi visiva in tempo reale di sistemi polidispersi che vanno da 10 nm a 50 nm, a circa 1000 nm di dimensione (a seconda delle proprietà del campione e della configurazione dello strumento). È necessaria una preparazione minima del campione. Nonostante la minima preparazione del campione, questo passaggio è fondamentale per il protocollo e si dovrebbe prestare molta attenzione quando si dilui un campione e si sceglie un diluente. La forma può essere un fattore limitante rispetto all'NTA in quanto si ottengono misurazioni sferiche di dimensioni equivalenti e le particelle non sferiche avranno un valore di dimensione meno accurato.
Per la tecnologia NTA, è sempre da aspettarsi una certa variazione dei risultati, poiché dall'intero campione si osserva solo un campione rappresentativo. Indipendentemente da ciò, tutti i risultati soddisfano lo standard ISO 19430 per il dimensionamento delle particelle. La concentrazione ottimale da fornire è tipicamente di circa 108 particelle/ml entro un tempo di analisi di 30-60 secondi. Per i campioni con concentrazioni di particelle più basse, saranno necessari tempi di analisi più lunghi per garantire risultati riproducibili. Per i campioni contenenti una concentrazione di particelle superiore a 109 particelle/mL, vi è una maggiore probabilità di problemi di tracciamento e i campioni dovranno essere diluiti in un intervallo adatto per la misurazione dell'NTA.
Nel complesso i risultati del3° Round ILC mostrano una buona riproducibilità delle misurazioni delle nanoparticelle d'oro con NTA con maggiore precisione e ripetibilità. Tutte le misurazioni NTA sono state eseguite utilizzando il livello automatico della fotocamera e le impostazioni di messa a fuoco per regolare l'immagine, come selezionato dalla funzione di configurazione automatica nel software. Il livello della fotocamera impostato dal software era molto coerente, con un livello della fotocamera di 10 o 11 impostato in tutti i casi che mostrava che, come previsto, più automazione un processo include più coerenza viene raggiunta. I risultati del dimensionamento erano paragonabili a quelli ottenuti dal fabbricante mediante TEM, il che indicava che i risultati erano riproducibili, tuttavia ci si può aspettare differenze minime da tecniche diverse poiché TEM non determina il diametro idrodinamico. Il significativo miglioramento della coerenza dei risultati mostra l'importanza e i vantaggi della manutenzione degli strumenti, delle SOP dettagliate, degli aggiornamenti delle migliori pratiche, delle conoscenze degli utenti e dell'automazione delle misurazioni applicate per l'NTA. In conclusione, l'ILC ha convalidato questo specifico SOP NTA e ha quindi introdotto fiducia e chiarezza in questo specifico metodo di valutazione del rischio dei nanomateriali.

I nanomateriali (NMs) possono variare sia nelle caratteristiche fisiche che chimiche che a loro volta influenzano il loro comportamento, stabilità e tossicità1,2,3,4,5. Una delle maggiori difficoltà, quando si sviluppa una comprensione approfondita delle proprietà, dei pericoli e dei comportamenti della MN, è la capacità di ottenere informazioni riproducibili sulle caratteristiche fisiche e chimiche dei nanomateriali. Esempi di tali proprietà fisiche includono la dimensione delle particelle e la distribuzione delledimensioni 6,7,8. Si tratta di parametri importanti in quanto sono un aspetto chiave della definizione (CE) della Commissione europea del termine "nano"9.
Il raggiungimento di misurazioni precise delle dimensioni delle particelle è fondamentale anche per molte diverse applicazioni e processi industriali e di ricerca, oltre a comprendere gli effetti del destino e della tossicità degli NMs6,10. È importante avere metodi ben consolidati in grado di misurare in modo accurato, affidabile e riproducibile le dimensioni degli TM. Inoltre, le informazioni riportate dovrebbero fornire una comprensione approfondita della tecnica utilizzata, ad esempio, indicare il tipo di parametro di dimensione (ad esempio, dimensioni effettive o dimensioni idrodinamiche) nonché la condizione del campione, ad esempio il mezzo specifico in cui è presente la MN, e che il metodo funzioni in modo affidabile in diversi supporti. Al fine di misurare le dimensioni, è possibile utilizzare un certo numero di tecniche, tra cui microscopia elettronica (EM), scattering dinamico della luce (DLS), spettrometria di massa plasmatica accoppiata induttivamente a singola particella (spICP-MS), sedimentazione centrifuga differenziale (DCS), microscopia a scansione di sonda (SPM), scattering a raggi X ad angolo ridotto (SAXS) e analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA).
L'NTA è una tecnologia relativamente nuova che è stata a buon punto negli ultimi anni e ha dimostrato di misurare in modo affidabile il diametro idrodinamico degli NM sferici in complessi mezzi acquosi come quelli con rilevanza ambientale, ad esempio i sistemi d'acqua dolce. Il diametro idrodinamico è «la dimensione di un'ipotetica sfera dura che si diffonde allo stesso modo di quella della particella misurata»11; in termini pratici e in mezzi acquosi questo descrive un diametro maggiore di quello della particella stessa, che include anche uno strato di molecole (per lo più acqua) tenuto sulla superficie della particella da deboli forze elettrostatiche. Il diametro idrodinamico di una particella varierà in diversi mezzi, diventando più piccolo man mano che la forza ionica del supporto in cui viene misurata diventa più alta.
Un'ulteriore caratteristica importante della tecnica NTA è che consente all'analista di ottenere misurazioni delle dimensioni ponderate in base al numero, che sono richieste nel contesto della definizione di nanomateriale CE. L'analisi ad alta risoluzione, particella per particella, rende questa tecnica meno soggetta a interferenze causate da agglomerati o particelle più grandi quando presente in un campione di prova eterogeneo con un alto tasso di velocità effettiva delleparticelle 10,12.
La procedura di misurazione consiste nel preparare un'adeguata sospensione del campione, che spesso richiede la diluizione del campione, seguita dalla registrazione video del comportamento del moto browniano delle particelle e dall'analisi video. Dalla camera campione, viene passato un raggio laser e le particelle di sospensione nel percorso della luce di dispersione del raggio laser che portano alla loro visualizzazione utilizzando un microscopio ottico con una fotocamera montata. La telecamera cattura un file video della luce laser diffusa dalle particelle che si muovono sotto il moto browniano. Molte particelle possono essere tracciate individualmente per determinare i loro coefficienti di diffusione e i loro diametri idrodinamici possono essere calcolati usando l'equazione di Stokes-Einstein: d = kT/3πηD dove d è il diametro idrodinamico, k è la costante di Boltzmann, T è la temperatura, η è la viscosità e D è il coefficiente di diffusione10. NTA può anche essere utilizzato per tracciare il comportamento di aggregazione di particelle generalmente colloidalmente instabili (le particelle devono, tuttavia, essere colloidalmente stabili sulla scala dei tempi di misurazione)13,14. NTA è un metodo assoluto e non è richiesta alcuna calibrazione del sistema sullo strumento utilizzato in questo lavoro. Se gli utenti vogliono controllare le prestazioni del sistema, questo può essere fatto facilmente misurando i materiali standard di dimensioni tutte le volte che si desidera.
Lo strumento NTA è facile da usare con tempi di analisi rapidi (meno di 10 minuti per campione). Per misurazioni di alta qualità con una buona ripetibilità e riproducibilità dei dati, è necessario considerare una serie di fattori sia nella preparazione del campione che nel funzionamento dello strumento. Se tali fattori non vengono attentamente considerati, le misurazioni sullo stesso materiale in laboratori e operatori diversi possono essere soggette a incertezze sconosciute o scarsamente quantificate. Durante la caratterizzazione NP, l'utilizzo di SOP sviluppate internamente con le migliori pratiche non sempre garantiscela coerenza con altri laboratori, come dimostrato da Roebben et al.
Infatti, una prima (prima tornata) NTA ILC tra diversi laboratori, utilizzatori e strumenti ha rivelato risultati incoerenti. Uno dei problemi principali era l'uso di vari strumenti legacy più vecchi che non avevano avuto servizi regolari o controlli di taratura, nonché differenze nell'interpretazione dei metodi. Uno studio dell'NTA ILC di Hole et al. Questo insieme ai risultati della prima tornata dell'ILC evidenzia la necessità di una buona manutenzione degli strumenti, nonché di una formazione sui metodi e di procedure operative standard ben sviluppate (SOP). Questi ultimi fungono da potente strumento per descrivere e documentare il rispetto delle buone pratiche. Se ben dettagliate, le procedure operative standard (SOP) possono offrire chiarezza, spiegazione, comprensione, standardizzazione e garanzia della qualità.
La raccomandazione per l'adozione di uno studio ILC è quindi ideale sia per lo sviluppo che per la sperimentazione deiprotocolli 16. L'esercizio ILC ha agito per convalidare questo specifico SOP NTA e ha quindi introdotto fiducia e chiarezza in questo specifico metodo di valutazione del rischio dei nanomateriali. Ha comportato tre round. Il round 1 ha analizzato nanoparticelle d'oro a 60 nm sugli strumenti di ciascun partecipante prima dell'allenamento. Il round 2 prevedeva l'analisi del lattice a 100 nm utilizzando un nuovo strumento con configurazione comune come semplice test al fine di determinare che lo strumento era impostato correttamente e gli utenti avevano una buona conoscenza su come utilizzare lo strumento. Il round 3 ha comportato l'analisi di nanoparticelle d'oro a 60 nm sul nuovo strumento con configurazione comune, dopo l'allenamento. I partecipanti all'ILC provenivano da sette diversi laboratori, tutti membri del consorzio del progetto Horizon 2020 ACEnano17.
Lo scopo di questo articolo è discutere il metodo e i risultati di una terza tornata di benchmarking per la tecnologia NTA in cui i PN d'oro a 60 nm sono stati ri-analizzati da sette partner a seguito di una formazione dettagliata e dello sviluppo sop. Verranno inoltre effettuati confronti e riferimenti ai risultati ottenuti nella prima tornata dell'ILC. Tutte le analisi del round 3 dell'ILC sono state effettuate utilizzando lo stesso strumento (vedi Tabella dei Materiali)di identica configurazione fornita con un laser a 405 nm e una telecamera sCMOS ad alta sensibilità. L'analisi comparativa valuta le prestazioni della tecnologia sui campioni e quindi porta allo sviluppo di protocolli sulle "migliori pratiche". Pertanto, questo articolo condivide e rende disponibile per la comunità scientifica anche il metodo NTA per lo strumento utilizzato in questo ILC, in quanto è stato armonizzato attraverso la conduzione e la valutazione degli ILC secondo gli standard internazionali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 nm gold colloid dispersion</td>
			<td>BBI Solutions OEM Ltd.</td>
			<td>Product EM. GC60, Batch number 024650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.02 &#181;m syringe filter - Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA68092102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical Ltd.</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA Software v3.4</td>
			<td>Malvern Panalytical Ltd.</td>
			<td>v3.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1&#160;mL, graduated, 0.01&#160;mL, sterile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z230723</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis of gold nanoparticles in aqueous media through an inter-laboratory comparison

Nel campo della nanotecnologia, la caratterizzazione analitica gioca un ruolo vitale nella comprensione del comportamento e della tossicità dei nanomateriali (NMs). La caratterizzazione deve essere approfondita e la tecnica scelta dovrebbe essere adatta alla proprietà da determinare, al materiale analizzato e al mezzo in cui è presente. Inoltre, il funzionamento e la metodologia dello strumento devono essere ben sviluppati e chiaramente compresi dall'utente per evitare errori di raccolta dei dati. Eventuali discrepanze nel metodo o nella procedura applicata possono portare a differenze e scarsa riproducibilità dei dati ottenuti. Questo documento mira a chiarire il metodo per misurare il diametro idrodinamico delle nanoparticelle d'oro mediante l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Questo studio è stato effettuato come confronto tra laboratori (ILC) tra sette diversi laboratori per convalidare le prestazioni e la riproducibilità della procedura operativa standard. I risultati ottenuti da questo studio ILC rivelano l'importanza e i vantaggi di procedure operative standard dettagliate (SOP), aggiornamenti delle best practice, conoscenze degli utenti e automazione delle misurazioni.

I risultati dell'ILC round 1 utilizzando varie configurazioni di strumenti NTA sono riportati nella figura 4. Ad eccezione di Lab 6, la ripetibilità tra le 5 ripetizioni di acquisizione era buona, ma diversi laboratori registrarono una dimensione della modalità superiore al previsto. I risultati del laboratorio 6 hanno mostrato una scarsa ripetibilità e una dimensione della modalità molto più elevata misurata. Dopo l'indagine, è stato riscontrato che i sistemi che segnalavano variazioni di dimensioni maggiori non sono stati mantenuti come raccomandato o l'analisi è stata influenzata da incoerenza nella preparazione del campione in cui la fase di diluizione può creare variazioni causate da diverse apparecchiature di pipettazione, funzionamento e tecnica dell'utente e / o misurazione impostata, compresa la cella di flusso non pulita, il livello della fotocamera errato utilizzato, l'immagine non è focalizzata correttamente e l'impostazione della soglia di rilevamento dell'analisi in modo errato.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig4v2.jpg"> Figura 4: Risultati dimensioni modalità ILC Round 1. Le dimensioni della modalità sono il risultato di tutti i partner di benchmarking NTA per la dispersione di nanoparticelle d'oro round 1 60 nm effettuata su diversi strumenti NTA (come abbreviato nell'asse x).
L'accuratezza del risultato NTA del round 3 è stata migliorata da tutti i laboratori che implementano le stesse impostazioni SOP e strumento. I risultati delle dimensioni della modalità ottenuti per questo ILC Round 3 sono visibili nella figura 5. La modalità media in tutti i laboratori era di 62,02 ± 1,97 nm. Tutti i risultati misurati del round 3 sono stati più coerenti dei risultati della prima fase, con i risultati che rientrano ben entro il 10% della dimensione media di 60,5 nm per il lotto, come indicato dal produttore. Il coefficiente di variazione per i campioni d'oro dichiarato dal produttore è stato ≤8%.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig5v2.jpg"> Figura 5: Risultati delle dimensioni della modalità ILC Round 3. Le dimensioni della modalità sono il risultato di tutti i partner di benchmarking NTA per 60 nm oro ILC Round 3 analizzato sullo stesso strumento NTA. La modalità media in tutti i laboratori era di 62,02 ± 1,97 nm.
Per verificare la dimensione delle particelle, come fornito dal produttore, un piccolo numero (N=82) di particelle è stato analizzato mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Circa 10 μl della dispersione non diluita sono stati gettati su una griglia Cu TEM rivestita di carbonio e asciugati nell'aria prima di essere imaging in un TEM analitico a 200 kV. Immagini come la figura complementare 1 sono state prese da aree con sovrapposizione minima di particelle e analizzate utilizzando un processo di analisi semiautomatica delle immagini. È stato applicato un metodo automatico di spartiacque a particelle separate e sono stati esclusi i manufatti di questo processo, nonché sulle particelle dispigolo 18. Il diametro medio è stato calcolato in media dall'asse maggiore e minore (61 ± 7 nm) o come conversione dall'area misurata (62 ± 6 nm) assumendo particelle sferiche. Le particelle sembrano essere per lo più sferiche con un rapporto di aspetto medio di 1,1. I risultati TEM mostrano un diametro leggermente superiore al valore del produttore (60,5 nm) ma rientrano nel livello di tolleranza. Inoltre, c'è un ottimo accordo con il valore derivato dall'NTA del diametro idrodinamico.
Figura complementare 1: Immagine TEM di nanoparticelle d'oro a 60 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741supfig01.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa cifra.</a>
File complementare 1: Script di misurazione. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/Measurement_script.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File aggiuntivo 2: Esempio di rapporto sui risultati PDF. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/PDF_results_report.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

Il protocollo qui descritto mira a misurare il diametro idrodinamico delle nanoparticelle sferiche, più specificamente nanoparticelle d'oro, in mezzi acquosi attraverso l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Quest'ultimo comporta il tracciamento del movimento delle particelle dovuto al moto browniano e l'implementazione dell'equazione di Stokes-Einstein per ottenere il diametro idrodinamico.

Analisi del tracciamento delle nanoparticelle di nanoparticelle d'oro nei media acquosi attraverso un confronto tra laboratori

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

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