Name: intravitreal injection and quantitation of infection parameters in a mouse model of bacterial endophthalmitis
Uploaded: 2021-02-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Feng Li og Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) for deres hjælp. Vores forskning er blevet støttet af National Institutes of Health tilskud R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, og R01EY024140. Vores forskning er også blevet støttet af P30EY21725 (NIH CORE tilskud til Live Animal Imaging and Analysis, Molekylær biologi, og Cellular Imaging). Vores forskning er også blevet støttet af NEI Vision Science Pre-ph.d.-trainee program 5T32EY023202, en Presbyterian Health Foundation Research Support tilskud, og en ubegrænset tilskud til Dean A. McGee Eye Institute fra Forskning for at forebygge blindhed.

Alle procedurer blev udført efter anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr og Association for Research in Vision og Oftalmology Statement for the Use of Animals in Oftalmmic and Vision Research. Protokollerne blev godkendt af Den Institutionelle Animal Care and Use Committee ved University of Oklahoma Health Sciences Center (protokol numre 15-103, 18-043, og 18-087).
1. Sterile glasnåle
<ol><li>Tænd for nålepipettetrækeren.</li>
	<li>Juster <str...

Selv med tilgængeligheden af potente antibiotika, anti-inflammatoriske lægemidler, og vitektomi kirurgi, bakteriel endophthalmitis kan blinde en patient. Kliniske undersøgelser har været nyttige i at studere endophthalmitis; imidlertid giver eksperimentelle modeller af endophthalmitis hurtige og reproducerbare resultater, der kan oversættes til fremskridt inden for behandlingsstandard, hvilket resulterer i bedre visuelt resultat for patienterne.
Museøjets glasagtige volumen er ca. 7 μL<...

Bakteriel endophthalmitis er en ødelæggende infektion, der forårsager betændelse, og, hvis de ikke behandles ordentligt, kan resultere i tab af syn eller blindhed. Endophthalmitis skyldes, at bakterierne kommer ind i det indre af øjet1,2,3,4,5. Når i øjet, bakterier replikere, producere toksiner og andre skadelige faktorer, og kan forårsage uoprettelige skader på sarte retinale celler og væv. Øjenskader kan også være forårsaget af betændelse, på grund af aktivering af inflammatoriske veje, der fører til inflammatoriskcelletilstrømning i det indreaføjet1,5,6. Endophthalmitis kan forekomme efter intraokulært kirurgi (postoperativ), en gennemtrængende skade på øjet (posttraumatisk), eller fra metastatisk spredning af bakterier i øjet fra et andet anatomisk sted (endogen)7,8,9,10. Behandlinger for bakteriel endophthalmitis omfatter antibiotika, anti-inflammatoriske lægemidler, eller kirurgisk indgreb3,4,11. Selv med disse behandlinger, vision eller øjet selv kan gå tabt. Den visuelle prognose efter bakteriel endophthalmitis varierer generelt afhængigt af behandlingseffektiviteten, den visuelle skarphed ved præsentationen og den inficerende organismes virulens.
Bacillus cereus (B. cereus) er en af de vigtigste bakterielle patogener, der forårsager post-traumatisk endophthalmitis7,12. Et flertal af B. cereus endophthalmitis tilfælde har en hurtig kurs, hvilket kan resultere i blindhed inden for et par dage. Kendetegnende for B. cereus endophthalmitis omfatter hurtigt udvikler intraokulært inflammation, øjensmerter, hurtigt tab af synsstyrke, og feber. B. cereus vokser hurtigt i øjet i forhold til andrebakterier,som almindeligvis forårsager øjeninfektioner2,4,12 og besidder mange virulensfaktorer. Derfor er vinduet for vellykket terapeutisk interventionrelativt kort 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Behandlinger for denne infektion er normalt en succes i behandling af endophthalmitis forårsaget af andre mindre virulente patogener, men B. cereus endophthalmitis almindeligvis resulterer i større end 70% af patienter, der lider af betydelige synstab. Omkring 50% af disse patienter gennemgår udtagning eller enucleation af det inficerede øje7,16,22,23. Den destruktive og hurtige karakter af B. cereus endophthalmitis kræver øjeblikkelig og korrekt behandling. De seneste fremskridt med hensyn til at skelne de underliggende mekanismer for sygdomsudvikling har identificeret potentielle mål for intervention19,26,27. Eksperimentelle musemodeller af B. cereus endophthalmitis fortsat være nyttige i at skelne mekanismerne for infektion og test potentielle terapeutiske, der kan forhindre synstab.
Eksperimentel intraokulært infektion af mus med B. cereus har været en instrumental model for forståelse af bakterielle og værtsfaktorer, samt deres interaktioner, under endophthalmitis28. Denne model efterligner en post-traumatisk eller post-operative begivenhed, hvor bakterier indføres i øjet under en skade. Denne model er meget reproducerbar og har været nyttig til afprøvning af eksperimentelle behandlingsformer og tilvejebringelse af data til forbedringer i standarden for pleje1,6,19,29,30. Ligesom mange andre infektion modeller, denne model giver mulighed for uafhængig kontrol af mange parametre for infektion og muliggør en effektiv og reproducerbar undersøgelse af infektion resultater. Undersøgelser i en lignende model hos kaniner i de seneste årtier har undersøgt virkningerne af B. cereus virulensfaktorer iøjet 2,4,13,14,31. Ved at indsprøjte B. cereus mutant stammer mangler individuelle eller flere virlensfaktorer, kan bidraget af disse virulensfaktorer til sygdommens sværhedsgrad måles ved resultater såsom koncentration af bakterier ved forskellige tidspunkter efter infektion eller tab af visuel funktion13,14,27,31,32. Desuden er værtsfaktorer blevet undersøgt i denne model ved at inficere knockout musestammer, der mangler specifikke inflammatoriske værtsfaktorer26,29,33,34,35. Modellen er også nyttig til at teste potentielle behandlinger for denne sygdom ved at indsprøjte nye forbindelser i øjet efter infektion30,36. I dette manuskript beskriver vi en detaljeret protokol, som omfatter at inficere et museøje med B. cereus,høste øjet efter infektion, kvantificere intraokulært bakteriebelastning og bevare prøver for at analysere yderligere parametre for sygdommens sværhedsgrad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L pipette</td>
			<td>RANIN</td>
			<td>L0696003G</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37oC Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-690-625D</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>90003-032</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Microinjector</td>
			<td>MicroData Instrument, Inc.</td>
			<td>PM2000</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads 1.0 mm</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079110</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>NB-I2400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary Pipets 5 Microliters</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>71900-5</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Pipette Beveler</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>BV-10</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiostar Plus</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope OPMI Lumera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette 30-300 &#181;L</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>15626090</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette 5-100 &#181;L</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>9143724</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle/Pipette Puller</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>730</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1897315</td>
			<td>Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse action forceps</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K5-8228</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravitreal injection and quantitation of infection parameters in a mouse model of bacterial endophthalmitis

Intraokulære bakterielle infektioner er en fare for synet. Forskere bruger dyremodeller til at undersøge værten og bakterielle faktorer og immunrespons veje forbundet med infektion til at identificere levedygtige terapeutiske mål og til at teste lægemidler til at forebygge blindhed. Den intravitreal injektion teknik bruges til at injicere organismer, narkotika, eller andre stoffer direkte ind i glaslegemen i den bageste del af øjet. Her demonstrerede vi denne injektionsteknik for at starte infektion i museøjet og teknikken med kvantificering af intraokulære bakterier. Bacillus cereus blev dyrket i hjernens hjerteinfusion flydende medier i 18 timer og resuspenderet til en koncentration 100 kolonidannende enheder (CFU)/0,5 μL. En C57BL/6J mus blev bedøvet ved hjælp af en kombination af ketamin og xylazin. Ved hjælp af en picoliter mikroinjektor og glas kapillær nåle, 0,5 μL af Bacillus suspension blev injiceret i midten glaslegeme af museøjet. Det kontralaterale kontroløje blev enten injiceret med sterile medier (kirurgisk kontrol) eller blev ikke injiceret (absolut kontrol). Efter 10 timer efter infektion blev mus aflivet, og øjnene blev høstet ved hjælp af sterile kirurgiske pincet og placeret i et rør, der indeholder 400 μL steril PBS og 1 mm sterile glasperler. For ELISAs eller myeloperoxidase assays, proteinase hæmmer blev tilsat til rørene. Til RNA-ekstraktion blev den relevante lysisbuffer tilsat. Øjnene blev homogeniseret i en vævshomogenisator i 1-2 minutter. Homogenater blev seriefortyndet 10 gange i PBS og spor fortyndet på agar plader. Resten af homogenaterne blev opbevaret ved -80 °C for yderligere analyser. Pladerne blev inkuberet i 24 timer, og CFU pr. øje blev kvantificeret. Disse teknikker resulterer i reproducerbare infektioner i museøjne og lette kvantiteten af levedygtige bakterier, værten immunrespons, og omics af vært og bakteriel genekspression.

Generering af en reproducerbar inokulum og nøjagtigheden af den intravitreale injektion procedure er vigtige trin i udviklingen af modeller af mikrobiel endophthalmitis. Her viste vi den intravitreale injektionsprocedure ved hjælp af Gram-positiv Bacillus cereus. Vi injicerede 100 CFU/0,5 μL B. cereus i midten af glaslege udglasset med fem C57BL6-mus. Efter 10 timer efter infektion observerede vi intraokulært vækst af B. cereus til ca. 1,8 x 105 CFU/eye. Fig...

Watch this Scientific Journal Video about Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis at JoVE.com

Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis

Vi beskriver her en metode til intravitreal injektion og efterfølgende bakteriel kvælning i musemodel af bakteriel endophthalmitis. Denne protokol kan udvides til måling af værtens immunrespons og bakterielle og værtsgenetielle udtryk.

Intravitreal injektion og kvantisering af infektionsparametre i en musemodel af bakteriel endophthalmitis

Intraocular bacterial infections are a danger to the vision. Researchers use animal models to investigate the host and bacterial factors and immune ...

Vores protokol giver mulighed for reproducerbar indførelse af mikroorganisme og terapeutiske midler i museøjet for at studere patogenesen af intraokulært infektion og ny behandling effektivitet. Vores teknik gør det muligt at etablere intraokulære infektioner i en musemodel og letter kvanteringen af mikroorganismer, værtsre immunrespons, infektionsrelateret vært og patogengenkspression og ny behandlingseffektivitet. Visualisering af injektionsstedet, nålevinkel og levering er afgørende for en vellykket udførelse af denne teknik, og en ordentlig øjenhøst er afgørende for kvantificeringen af infektionsparametrene.I en biosikkerhed niveau to facilitet, tilføje fem milliliter BHI bouillon til en 10 milliliter snap cap rør og bruge en steril løkke til at overføre en enkelt B.cereus koloni fra en snegl plade kultur i fem milliliter bouillon. Efter kort vortexing, inkubere prøven i en 37 grader Celsius roterende inkubator på 200 omdrejninger i minuttet i 18 timer. Ved inkubationens afslutning fortyndes kulturen til en 200 koloni, der danner enheder pr. mikroliterkoncentration i 10 milliliter frisk BHI, og efter vortexing tilsættes en milliliter af den nyfortyndede kultur til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør på is.Ved intravitreal injektion tændes mikroinjektoren, og gasventilen på tryklufttanken, der er fastgjort til mikroinjektoren, åbnes. Tryk på Tilstanden på mikroinjektoren, indtil skærmen viser Balance. Tryk på Balance, og placer computermusen på operationsbordet.Tilslut pipetteholderen i rustfrit stål til slangen fastgjort til påfyldningsudgangen på injektoren, og skru pipettens stik omkring en skråt glaskapillær pipettespidsnål for at gøre det muligt at indsætte kapillærnålen i den anden ende af pipetteholderen. Tænd for det oftalmologiske mikroskop og indstil lysintensiteten til 50%Placer mikroskopet over procedurestedet, og juster mikroskopet til det ønskede fokus. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på pedal refleks, placere bedøvet musen på sin venstre side på den medicinske underpads med næsen pegede til højre.Find det højre øje gennem det oftalmologiske mikroskop mål og placere tang af omvendt handling tang på hver side af øjet til at udsætte injektionsstedet. Venstre klik musen forbundet til mikroinjektoren til at fylde den forberedte kapillær nål med fortyndet bakterier løsning, og sikring af hovedet med venstre hånd, skal du placere spidsen af nålen, facet side op, på limbus af øjet. Med nålen i en 45 graders vinkel, punktere øjet, idet du skal passe på, at kun 0,5 millimeter af den skarpe spids af nålen er indsat.Når nålespidsen er sat i, skal du bruge venstre hånd til at højreklikke på musemåtten for at injicere 0,5 mikroliter af B.cereus-opløsningen. For at undgå lækage skal du lade nålespidsen komme ind i museøjet i to til tre sekunder, før du fjerner den, og slip derefter forpindene, og øjet går tilbage i soklen af sig selv. Overfør musen til et bjærgningsbur på en opvarmning pad med overvågning, indtil fuld recumbency.Ved det relevante eksperimentelle endepunkt tilsættes 400 mikroliter PBS suppleret med proteasehæmmer i et mærket, autoklaveret høstrør pr. øje på is og placer åbne fine spidsforrænkning på hver side af det inficerede øje. Skub spidserne ned mod hovedet for at proptose øjet. Når tangen er bag øjet kloden, klemme tang sammen og trække tang væk fra hovedet for at frigøre øjeæblet.Derefter straks placere øjeæblet i passende mærket høst rør. Inden for 60 minutter efter indsamling af prøver anbringes de lukkede høstrør i en vævshomogenisator, og prøverne homogeniseres i to, et minuts homogeniseringsperioder med en hvileperiode på 30 sekunder imellem. Efter homogeniseringen skal prøverne på isen anvendes, og der anvendes 20 mikroliter aliquots homogenat for at fortynde prøverne i 180 mikroliter PBS pr. fortynding, indtil en faktor på en gang 10 til de negative otte er nået.Dernæst skal du mærke hver række af en firkantet forvarmt BHI plade med passende fortynding koncentration, og med pladen vippes i en 45 graders vinkel, tilføjes 10 mikroliter af hver fortynding i individuelle rækker øverst på pladen. Lad hver prøve køre, indtil den næsten når bunden af pladen, før du lægger pladen fladt. Når prøverne er blevet absorberet i agaren, overføres pladen til en 37 grader Celsius-inkubator.Kolonier bør begynde at være synlige efter otte timers inkubation. For at opnå en nøjagtig gengivelse af koncentrationen i prøven skal du tælle den række, der har mellem 10 og 100 kolonier. Konstruktionen af en skrå glas nål spids er afgørende for at levere bakterier i midten glaslegembund af museøjet.I disse billeder, Bacillus cereus vokser på en blod agar plade og i bouillon kultur rør er vist. Som illustreret i denne graf af interokulære bakterietal fra fem forskellige museøjne ved 10 timer efter infektion mellem en gang 10 til den femte og en gange 10 til den syvende koloni danner enheder af bakterier kan typisk inddrives fra en enkelt inficeret øje. Det vigtigste at huske, når du forsøger denne procedure er at injicere, at passende mængde af bakterier i museøjet.Efter denne procedure kan vi studere inflammation ved histologi, inflammatoriske mediatorer af ELISA, og genekspression ved høj gennemløb RNA sekventering for at lette en bedre forståelse af patogenesen af denne sygdom.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Opdræt og Injektion af<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larver at vurdere bakteriel virulens

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza A Virus undersøgelser i en musemodel af infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Dyb Dermal injektion som en Model af Candida albicans hudinfektion histologisk analyser

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intrakranielle Subarachnoidal rute for infektion for at undersøge roller af Streptococcus suis biofilm i Meningitis i en musemodel infektion

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

En neonatal Imaging Model af Gram-Negative bakteriel sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

En musemodel af kronisk leverfibrose til undersøgelse af galde atresi

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Induktion af parodontitis via en kombination af ligatur og lipopolysaccharidinjektion i en rottemodel

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, ...

Etablering af en musemodel til Candida albicans biofilm-relateret PJI

A Periprosthetic Joint Candida albicans Infection Model in Mouse

Forfatter Spotlight: Fremme af forskning i Candida albicans biofilm-associerede proteseinfektioner 

En periprostetisk fælles Candida albicans infektionsmodel i mus

Periprosthetic joint infection (PJI) is one of the common infections caused by Candida albicans (C. albicans), which increasingly concerns surgeons and ...