Name: intravitreal injection and quantitation of infection parameters in a mouse model of bacterial endophthalmitis
Uploaded: 2021-02-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis at JoVE.com

Авторы благодарят д-р Фэн Ли и Марк Диттмар (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Дин А. МакГи глаз институт, Оклахома-Сити, OK, США) за их помощь. Наше исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения гранты R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, и R01EY024140. Наше исследование также было поддержано P30EY21725 (грант NIH CORE для живой визуализации и анализа животных, молекулярной биологии и клеточной визуализации). Наши исследования также были поддержаны NEI Vision Science Pre-докторской программы стажера 5T32EY023202, пресвитерианского фонда здравоохранения научно-исследовательской поддержки гранта, а также неограниченный грант декан а. МакГи глаз института исследований для предотвращения слепоты.

Все процедуры были выполнены в соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии Заявление для использования животных в офтальмологических и исследования зрения. Протоколы были одоб...

Даже при наличии мощных антибиотиков, противовоспалительных препаратов и витректомии, бактериальный эндофтальмит может ослепить пациента. Клинические исследования были полезны в изучении эндофтальмита; однако экспериментальные модели эндофтальмита обеспечивают быстрые и воспроиз...

Бактериальный эндофтальмит является разрушительной инфекцией, которая вызывает воспаление, и, если не лечить должным образом, может привести к потере зрения или слепоты. Эндофтальмит является результатом проникновения бактерий ввнутреннюю часть глаза 1,2,3,4,5. Оказавшись в глазу, бактерии размножаются, производят токсины и другие вредные факторы, и может привести к необратимым повреждениям тонких клеток сетчатки и тканей. Повреждение глаз также может быть вызвано воспалением, из-за активации воспалительных путей, ведущих к воспалительному притокуклеток в внутреннюю часть глаза 1,5,6. Эндофтальмит может возникнуть после внутриглазной хирургии (послеоперационной), проникающей травмы глаза (посттравматического), или от метастатического распространения бактерий в глаз из другого анатомического участка (эндогенного)7,8,9,10. Лечение бактериального эндофтальмита включает антибиотики, противовоспалительные препараты или хирургическоевмешательство 3,4,11. Даже с этими процедурами, зрение или сам глаз могут быть потеряны. Визуальный прогноз после бактериального эндофтальмита обычно варьируется в зависимости от эффективности лечения, остроты зрения при презентации и вирулентности инфекционного организма.
Bacillus cereus (B. cereus) является одним из основных бактериальных патогенов, который вызывает посттравматическийэндофтальмит 7,12. Большинство случаев эндофтальмита B. cereus имеют быстрый курс, который может привести к слепоте в течение нескольких дней. Отличительными чертами эндофтальмита B. cereus являются быстро развивающееся внутриглазное воспаление, боль в глазах, быстрая потеря остроты зрения и лихорадка. B. cereus быстро растет в глазу по сравнению с другими бактериями, которые обычно вызываютглазные инфекции 2,4,12 и обладает многими факторами вирулентности. Таким образом, окно для успешного терапевтическоговмешательства относительно короткое 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Лечение этой инфекции, как правило, успешно в лечении эндофтальмита, вызванного другими менее вирулентных патогенов, но B. cereus эндофтальмит обычно приводит к более чем 70% пациентов, страдающих от значительной потери зрения. Около 50% из этих пациентов проходят evisceration или enucleation инфицированногоглаза 7,16,22,23. Разрушительный и быстрый характер эндофтальмита B. cereus требует немедленного и надлежащего лечения. Недавний прогресс в различение основных механизмов развития болезни определили потенциальные цели длявмешательства 19,26,27. Экспериментальные модели мыши B. cereus эндофтальмит продолжают быть полезными в распознавании механизмов инфекции и тестирования потенциальных терапевтических средств, которые могут предотвратить потерю зрения.
Экспериментальная внутриглазная инфекция мышей с B. cereus была инструментальной моделью для понимания бактериальных и принимающих факторов, а также их взаимодействий, во время эндофтальмита28. Эта модель имитирует посттравматическое или послеоперационное событие, при котором бактерии вводятся в глаз во время травмы. Эта модель очень воспроизводится и была полезна для тестирования экспериментальной терапии и предоставления данныхдля улучшения стандарта ухода 1,6,19,29,30. Как и многие другие модели инфекции, эта модель позволяет осуществлять независимый контроль над многими параметрами инфекции и позволяет эффективно и воспроизводимое обследование исходов инфекции. Исследования в аналогичной модели у кроликов за последние несколько десятилетий изучили влияние факторов вирулентности B. cereus в глазу 2,4,13,14,31. Путем впрыскивать напряжения мутанта B. cereus нуждаясь индивидуальных или множественных факторах вирулентности, вклад этих факторов вирулентности к суровости заболевания можно измерить исходами such as концентрация бактерий на по-разному часах postinfection или потеря визуальнофункции 13,14,27,31,32. Кроме того, принимающие факторы были изучены в этой модели, заражая нокаутом штаммов мыши не хватаетконкретных воспалительных факторов хозяина 26,29,33,34,35. Модель также полезна для тестирования потенциальных методов лечения этого заболевания путем введения новых соединений в глаз послезаражения 30,36. В этой рукописи мы описываем подробный протокол, который включает в себя заражение мышеловки B. cereus,сбор глаз после инфекции, количественную оценку внутриглазной бактериальной нагрузки и сохранение образцов для анализа дополнительных параметров тяжести заболевания.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L pipette</td>
			<td>RANIN</td>
			<td>L0696003G</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37oC Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-690-625D</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>90003-032</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Microinjector</td>
			<td>MicroData Instrument, Inc.</td>
			<td>PM2000</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads 1.0 mm</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079110</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>NB-I2400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary Pipets 5 Microliters</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>71900-5</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Pipette Beveler</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>BV-10</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiostar Plus</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope OPMI Lumera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>Model 607</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette 30-300 &#181;L</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>15626090</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette 5-100 &#181;L</td>
			<td>Biohit</td>
			<td>9143724</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle/Pipette Puller</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>730</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1897315</td>
			<td>Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse action forceps</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K5-8228</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravitreal injection and quantitation of infection parameters in a mouse model of bacterial endophthalmitis

Внутриглазные бактериальные инфекции представляют опасность для зрения. Исследователи используют модели животных для исследования принимающих и бактериальных факторов и путей иммунного ответа, связанных с инфекцией, для выявления жизнеспособных терапевтических целей и тестирования препаратов для предотвращения слепоты. Метод внутривитреальной инъекции используется для инъекций организмов, лекарств или других веществ непосредственно в стекловидную полость в задней части глаза. Здесь мы продемонстрировали этот метод инъекций, чтобы инициировать инфекцию в глазу мыши и метод количественной оценки внутриглазных бактерий. Bacillus cereus выращивался в жидком средстве инфузии сердца мозга в течение 18 часов и перерасходулся в концентрацию 100 единиц формирования колонии (CFU)/0,5 МЛ. Мышь C57BL/6J была анестезирована с помощью комбинации кетамина и ксилазина. Используя микроинжектор пиколитера и стеклянные капиллярные иглы, 0,5 мкл подвески Bacillus был введен в середине стекловидного глаза мыши. Контралатеральный контрольный глаз либо вводили стерильными средствами (хирургический контроль), либо не вводили (абсолютный контроль). В 10 часов после заражения мышей усыпляли, а глаза собирали с помощью стерильных хирургических пинцетов и помещали в трубку, содержащую стерильные PBS 400 МЛ и 1 мм стерильные стеклянные бусины. Для анализов ELISAs или миелопероксидазы в трубки был добавлен ингибитор протеиназы. Для извлечения РНК был добавлен соответствующий буфер лиза. Глаза гомогенизировались в тканевом гомогенизаторе в течение 1-2 минут. Гомогенаты были последовательно разбавлены 10 раз в PBS и трек разбавленных на агар пластин. Остальные гомогенаты хранились при -80 градусов по Цельсию для дополнительных анализов. Плиты были инкубированы в течение 24 часов и CFU на глаз был количественно. Эти методы приводят к воспроизводимым инфекциям в глазах мыши и облегчают количественную оценку жизнеспособных бактерий, иммунного ответа хозяина и омиков экспрессии генов хозяина и бактерий.

Создание воспроизводимой инокулы и точность процедуры внутривитреальной инъекции являются ключевыми шагами в разработке моделей микробного эндофтальмита. Здесь мы продемонстрировали процедуру внутривитреальной инъекции с помощью Грам-положительного Bacillus cereus. Мы ввели 100 CFU/0,5 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis at JoVE.com

Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis

Здесь описан метод интравитреальной инъекции и последующей бактериальной количественной оценки в мышиной модели бактериального эндофтальмита. Этот протокол может быть расширен для измерения иммунных реакций хозяина и бактериальной и экспрессии генов-хозяина.

Интравитреальная инъекция и количественная оценка параметров инфекции в мышиной модели бактериального эндофтальмита

Intraocular bacterial infections are a danger to the vision. Researchers use animal models to investigate the host and bacterial factors and immune ...

Наш протокол позволяет воспроизводимое введение микроорганизмов и терапевтических средств в глаз мыши для изучения патогенеза внутриглазной инфекции и новой эффективности лечения. Наша методика позволяет внутриглазных инфекций, которые будут созданы в модели мыши и облегчает количественной оценки микроорганизмов, принимающей иммунной реакции, инфекции, связанные с принимающей и патогенной экспрессии генов, и новая эффективность лечения. Визуализация места инъекции, угол иглы и доставка имеют решающее значение для успешного выполнения этого метода и надлежащего сбора глаз имеет важное значение для количественной оценки параметров инфекции.В биобезопасности уровне два объекта, добавить пять миллилитров бульона BHI в 10 миллилитров оснастки крышка трубки и использовать стерильную петлю для передачи одной колонии B.cereus из культуры ожитель пластины в пять миллилитров бульона. После краткого вихря, инкубировать образец в 37 градусов по Цельсию вращающегося инкубатора на 200 оборотов в минуту в течение 18 часов. В конце инкубации разбавьте культуру до 200 единиц на микролитр концентрации в 10 миллилитров свежего BHI, а после вихря добавьте один миллилитр свежеотбавленной культуры в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку на льду.Для внутривитреального впрыска включите микроинъектор и откройте газовый клапан на сжатом воздушном баке, прикрепленном к микроинъектору. Режим нажмите на микроинъектор до тех пор, пока на экране не будет показан баланс. Нажмите баланс и поместите компьютерную мышь на операционный стол.Подключите держатель пипетки из нержавеющей стали к трубе, прикрепленной к выходу заполнения на инжекторе, и плотно привинчивите разъем держателя пипетки вокруг скошенной стеклянной капиллярной иглы, чтобы позволить вставить капиллярную иглу в другой конец держателя пипетки. Включите офтальмологический микроскоп и установите интенсивность света до 50%Позиция микроскопа над местом процедуры и настроить микроскоп к желаемому фокусу. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, поместите анестезировал мышь на левой стороне на медицинские underpads с носом указал на право.Найдите правый глаз через офтальмологический микроскоп цели и место щипцы обратного действия щипцы по обе стороны от глаза, чтобы разоблачить место инъекции. Слева щелкните мышь, подключенную к микроинъектору, чтобы заполнить подготовленную капиллярную иглу раствором разбавленных бактерий, и закрепив голову левой рукой, поместите кончик иглы, скошенную сторону вверх, на лимбус глаза. С помощью иглы под углом 45 градусов проткнули глаз, заботясь о том, чтобы только 0,5 миллиметра острого кончика иглы вставлялись.После того, как кончик иглы был вставлен, используйте левую руку вправо нажмите на коврик для мыши, чтобы ввести 0,5 микролитров раствора B.cereus. Чтобы предотвратить утечку, оставьте кончик иглы внутри мыши глаза в течение двух-трех секунд, прежде чем удалить, а затем отпустите типсы и глаз вернется в гнездо сам по себе. Перенесите мышь в клетку восстановления на нагревание площадку с мониторингом до полного лежачих.В соответствующей экспериментальной конечной точке добавьте 400 микролитров PBS, дополненных ингибитором протеазы в одной помеченной, автоклавной трубке сбора урожая на глаз на льду и поместите открытые тонкие миппы кончика по обе стороны от инфицированного глаза. Нажмите кончики вниз к голове, чтобы опора глаза. После того, как щипцы находятся за шаром глаз, сожмите щипцы вместе и вытащить щипцы от головы, чтобы отделить глазное яблоко.Затем немедленно поместите глазное яблоко в соответствующую помеченную трубку для сбора урожая. В течение 60 минут после сбора образцов поместите закрытые трубки для сбора урожая в одногенизатор тканей и гомогенизируйте образцы в течение двух, одной минуты периодов гомогенизации с 30-секундным периодом отдыха между ними. После гомогенизации поместите образцы на лед и используйте 20 микролитров алицитов гомогената, чтобы последовательно разбавить образцы в 180 микролитров PBS на разбавление, пока не будет достигнут один раз от 10 до отрицательной восьмерки.Далее, этикетка каждого ряда квадратной предварительно разогретой пластины BHI с соответствующей концентрацией разбавления, и с пластиной наклонена под углом 45 градусов, добавить 10 микролитров каждого разбавления в отдельные ряды в верхней части пластины. Пусть каждый образец работает, пока он почти не достигнет нижней части пластины перед укладкой пластины плоской. Когда образцы были поглощены в агар, перенесите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию.Колонии должны начать быть видны после восьми часов инкубации. Для точного представления концентрации в выборке подсчитайте строку, которая имеет от 10 до 100 колоний. Конструкция скошенной стеклянной иглы наконечник имеет решающее значение для доставки бактерий в середине стекловидного глаза мыши.На этих снимках показаны бациллы cereus, растущие на пластине агара крови и в трубках культуры бульона. Как показано на этом графике внутриглазных бактериальных рассчитывает из пяти различных глаз мыши на 10 часов после заражения от одного раза 10 до пятого и один раз от 10 до седьмой колонии формирования единиц бактерий, как правило, могут быть извлечены из одного инфицированного глаза. Самое главное помнить при попытке этой процедуры заключается в том, чтобы придать, что соответствующий объем бактерий в мышиный глаз.После этой процедуры, мы можем изучить воспаление по гистологии, воспалительные посредники ELISA, и экспрессия генов с высокой пропускной способностью РНК секвенирования, чтобы облегчить лучшее понимание патогенеза этого заболевания.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Выращивание и инъекции<em&gt; Manduca Sexta</em&gt; Личинки для оценки бактериальной вирулентности

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Измерение Тактильная аллодиния в мышиной модели бактериальный простатит

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Исследования вирусов гриппа A в мышиной модели инфекции

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Глубокий дермальный инъекции как модель кожи инфекции Candida albicans для гистологического анализа

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Внутричерепная Subarachnoidal маршрут инфекции для расследования роли Streptococcus suis биоплёнки в менингита в мышиной модели инфекции

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Неонатальная модель визуализации грамотрицательных бактериальных сепсисов

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Мышиная модель хронического фиброза печени для изучения атрезии желчевыводящих путей

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Индукция пародонтита с помощью комбинации лигатуры и инъекции липополисахарида на крысиной модели

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, ...

Создание мышиной модели для биопленочной PJI Candida albicans

A Periprosthetic Joint Candida albicans Infection Model in Mouse

В центре внимания автора: Продвижение исследований биопленочных инфекций протезов суставов Candida albicans 

Модель перипротезной инфекции сустава Candida albicans у мышей

Periprosthetic joint infection (PJI) is one of the common infections caused by Candida albicans (C. albicans), which increasingly concerns surgeons and ...