Name: systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries
Uploaded: 2021-03-31T12:30:00
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我们感谢联合国ESP化学研究所（NuBBE）的比奥莱奥·德·比奥恩萨奥斯、比奥森特塞·埃·普罗杜托斯·纳图拉伊斯（NuBBE）为植物材料的编写提供实验室。我们还感谢牙科材料和普罗斯特霍顿学部、UNESP、阿拉夸拉/SP的应用微生物实验室。这项研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP #2013/07600–3 至 AJC）的研究资助和奖学金以及间接费用基金 （FAPESP #2017/07408-6 和 FAPESP #2019/23175-7 到 SMR） 的支持： #2011/21440–3 和#2012/21921–4 至 PCPB）。国家科学和技术发展委员会与FAPESP合作提供了额外支持（国家科学技术中心#465637/2014-0和FAPESP#2014/50926-0至AJC）。

1. 植物材料收集
<ol><li>植物材料<ol>
<li>在电子平台上记录获得植物材料的情况，该平台将规范在进行采集的国家获得遗传遗产的情况。例如，在巴西，向国家遗传遗产和相关传统知识管理系统注册-SisGen（网站 https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx）。</li>
		<li>收集感兴趣的植物材料的样本（例如叶子、茎、根、花、水果）。如果材料是在生殖阶段或植物阶段收集的，请进行登记。</li>
		<li>记录收集参?...

与天然原油提取物工作相关的主要挑战包括其复杂的组成和经典生物制导隔离研究的不足。虽然这个过程是缓慢的，但它是有效的，并导致在NP研究的主要发现。为了合理化，需要优先级驱动的研究来合理化。因此，使用现代化学分析方法分析CE和分离前的复制是重要的特征研究材料，特别是有用的，以避免重新隔离已知化合物与已经描述的生物活性2，15。<...

社会中最早使用的药物模型以天然产品为基础。从那时起，人类一直在寻找新的化学物质在自然界中，可以转化为药物1。这一搜索使民族植物筛查的技术和方法不断改进。NPs 提供了结构多样化物质的丰富来源，具有广泛的生物活动，可用于开发替代疗法或辅助疗法。然而，固有的复杂植物矩阵使得活性化合物的分离和鉴定成为一项具有挑战性和耗时的任务。
基于NPs的药物或配方可用于预防和/或治疗影响口腔的几种疾病，包括牙科蛀牙4。牙科蛀牙是全球最普遍的慢性疾病之一，它源于牙齿表面形成的富含糖分的饮食和微生物生物膜（牙菌斑）的相互作用，导致微生物代谢产生的有机酸导致脱氧，如果不治疗，会导致牙齿脱落5、6。虽然其他微生物可能与7有关，但链球菌是一种关键的致癌细菌，因为它是酸性、酸性且细胞外基质构建者。该物种编码多个外酶（如糖素转移酶或Gtfs），使用蔗糖作为基材8，以建立富含外聚糖精的细胞外基质，这是一个毒性决定因素9。此外，真菌念珠菌可以推动细胞外矩阵7的生产。尽管氟化物以各种方式施用，仍然是预防蛀牙10的基础，但需要新的方法作为辅助剂，以提高其有效性。此外，现有的抗斑块模式是基于使用广谱微生物制剂（如氯河西丁）11。作为替代方案，NPs是控制生物膜和预防蛀牙12，13的潜在疗法。
从植物中发现新的生物活性化合物的进一步进展包括必要的步骤或方法，例如：（一） 使用可靠和可重复的协议进行采样，考虑到植物往往表现出特异性：（二） 编制小规模的综合提取物及其各自的分数：（三） 其化学特征的定性和/或复制认为获取多维数据，例如GC-MS、LC-DAD-MS或NMR：（四） 使用可行的高产模型来评估生物活性：（五） 根据多变量数据分析或其他统计工具选择潜在的新热门歌曲：（六） 对目标化合物或有前途的候选人进行隔离和净化：和（七）使用分离化合物2，14对应生物活动的验证。
复制是快速识别原油提取物中已知化合物的过程，允许将新化合物与已经研究过的化合物区分开来。此外，当某些化合物已经描述生物活性时，这个过程可以防止隔离，并且特别有助于检测"频繁的击球手"。它已用于不同的非目标工作流程，从主要化合物识别或活动引导分馏的加速到提取物集合的化学剖析。它可以与代谢学研究完全集成，用于CE的非目标化学分析或代谢物的有针对性识别。所有这些最终导致在隔离程序1，15，16，17之前优先考虑提取物。
因此，在本手稿中，我们描述了从植物提取物和分数中识别抗菌和抗生物膜分子的系统方法。它包括四个多学科步骤：（1） 收集植物材料：（（二）制备粗制提取物和馏分，然后进行化学剖面分析：（3） 生物分析：（4）生物和化学数据分析（图1）。因此，我们提出了为分析 Cacasaria西尔维斯特里斯 提取物和针对 链球菌突变 体和 念珠菌13的分馏的抗菌和抗生物膜活动而制定的协议，以及植物化学特征和数据分析的程序。为了简单起眼，这里的重点是演示使用细菌筛选天然化合物的方法。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2.jpg"> 图1：系统方法的流程图，以识别植物提取物和分数中的活性分子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplates&#160;</td>
			<td>Kasvi</td>
			<td>Flat bottom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated carbon</td>
			<td>LABSYNTH</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>Ika LabortechniK</td>
			<td>Model A11 Basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column C18</td>
			<td>Phenomenex Kinetex</td>
			<td>150 &#215; 2.1 mm, 2.6 &#181;m, 100&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate reader</td>
			<td>Biochrom Ez</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>GraphPad Prism7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (a freeze dryer)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>Modulyo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Millipore</td>
			<td>LAC</td>
			<td>0.22 &#181;m x 13 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>Model G816&#8201;M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamide solid phase extraction cartridge</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>40&#8211;63&#8201;&#956;m, 60&#8201;&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>0,89% in water</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase extraction cartridges (SPE)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC-DAD</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ultimate 3000 RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>UNIQUE</td>
			<td>Model USC 2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries

天然产品提供结构不同的物质，具有无数的生物活动。然而，由于复杂的植物基质和耗时的隔离和鉴定程序，从植物中识别和分离活性化合物是具有挑战性的。因此，提出了一种从植物中筛选天然化合物的渐进方法，包括分离和识别潜在的活性分子。它包括植物材料的收集：原油提取物的准备和分馏;色谱和光谱学（UHPLC-DAD-HRMS和NMR）分析和化合物鉴定方法：生物分析（抗菌和抗生物膜活动;细菌"粘附力"到唾液颗粒和初始葡萄糖基质用选定的治疗治疗）：和数据分析。该模型简单、可重复，可持续控制多种化合物的高通量筛选、浓度和处理步骤。获得的数据为今后的研究提供了基础，包括含有最活跃提取物和/或分数的配方、分子的分离、微生物细胞和生物膜中特定目标的分子建模。例如，控制致癌生物膜的一个目标是抑制链 球菌突变 体葡萄糖转移酶的活性，这种转移酶合成细胞外基质的葡萄糖。这些酶的抑制可以防止生物膜的积累，降低其毒性。

我们提供了一个例子，使用系统的方法来筛选植物提取物和分数的生物活性，以确定潜在的活性分子为可能的新抗胆碱疗法：抗微生物和抗生物膜活性Cacaaria sylvestris提取物从不同的巴西生物群系对链球菌突变体和念珠菌13。
背景 特定口服微生物-宿主因子-富含蔗糖和淀粉的饮食之间的复杂相互作用可以调节致病生物膜的形...

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Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

天然产品是开发新药和治疗剂的有希望的起点。然而，由于化学多样性高，从植物中寻找新的治疗化合物是一项具有挑战性和耗时的任务。我们描述了从植物提取物和分数中识别抗菌和抗生物膜分子的简化方法。

从植物提取物和分数中识别新型抗菌和抗生物膜分子的系统方法，以防止牙科蛀牙

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

所展示的协议用于正确筛选和分析天然产品中的生物活性候选物，以控制口服生物膜。它也可以适应其他生物膜研究领域的应用。这种最淀粉筛选和分析的方法使得同时去除生物活性成分成为可能。牙科蛀牙是一种生物膜饮食衍生，高度流行，慢性疾病。该协议可以帮助识别天然产品，以控制生物膜，因此，牙科蛀牙。首先用水酒精混合物准备提取溶剂。您对每毫升提取溶剂的浓度进行 50 到 100 毫克的采样，并在微管中执行 15 分钟的超声波辅助提取。重复提取三次。每次提取步骤后，将样品离心以去除固体残留物并去除超纳坦。将每个提取步骤中的超纳丁混合并过滤它们。保存用于化学分析和生物分析的别名。对于分馏，用初始萃取溶剂稀释粗提取物样品，获得每毫升100毫克的溶液。然后，将一毫升样品转移到一个带一克吸附剂的预制固相萃取盒中，容量为六毫升。执行分馏，使用每个提取LUN的大约三个死卷，并通过LUN组成收集一个分数。保存阿里引用用于化学分析和生物分析。在真空、氮流或冻干下去除溶剂，并登记重量和产量。用最好的溶剂重组干物质。使用文本手稿中的公式计算库存溶液的溶剂浓度。在血液中重新激活S.mutans UA 159的微生物株，并在液体培养介质中培养它。使用相同的文化介质对初始文化进行一到二十次稀释，并孵化到达到中日志生长阶段。在 TYEG 中与定义人群一起准备抗微生物检测和 TYE 与 1% 蔗糖进行生物膜检测的接种。对于抗微生物活性，定义样本的浓度以供分析，并将其添加到 96 井板中。如文本手稿所述，在每个盘子中包括一组控件。使用 TYEG，将体积调整到 100 微升，接种 100 微升微生物培养物，并在 5% 的二氧化碳下在 37 摄氏度下孵育板 24 小时。通过对油井的目视检查，根据浊度分析细菌生长。在复制品中为特定的琼脂板中接种所需稀释的别名，并孵育板。孵化后，执行殖民地计数。在微管中称重羟基甲酸酯珠，并将其消毒。然后洗珠子，用吸附缓冲液Ab.添加500微升唾液到微管中形成唾液膜，在37摄氏度下孵育，每分钟24次旋转，持续40分钟。取出唾液超纳坦，用 Ab 洗珠三次，为下游检测做好准备。将500微升样品或控制器加入每个含有唾液颗粒珠子的微管中，并以每分钟24次旋转和37摄氏度孵育30分钟。用 Ab.添加 500 微升微生物培养物到每个微管中三次清洗珠子，并在类似条件下孵育一小时。然后用 Ab 缓冲器清洗未绑定的细胞三次。用一毫升 Ab 缓冲器重新悬念每个样品，在 7 瓦处重新悬念 30 秒。连续稀释每个悬架的点名，十倍，并把它们镀在特定的琼脂板上。在37摄氏度下以5%的二氧化碳孵育板48小时，并计算菌落。对于数据分析，将生物测定原始数据输入电子表格，并计算每个治疗的微生物生长抑制日志，以及微生物生长抑制日志百分比与控制相比。校正读数的光学密度，并计算生物质抑制的百分比。此处显示了在三个品种的 C.sylvestris 提取物（即西尔维斯特里、中间和通用语）中对克莱罗丹型二恶英和甘油酸的化学筛选量的化学剖析。在对原始数据进行分析后，四个摘录显示出良好的响应。这四个提取物的色谱数据显示了克莱罗丹型二恶烷和糖化黄酮类化合物的同时存在。此外，它们还包括相同的生物群系和品种。此处显示了经过处理的浮布细胞的 CFU、已处理生物膜的生物量百分比和处理生物膜的百分比 CFU。没有粗提取物显著影响粘附在唾液颗粒上的S.mutans细胞的去除。S.mutans细胞与葡萄糖基质的粘附被三种粗提取物削弱。由于每个植物物种都需要优化和特定的化学分析方法，因此必须从以前的报告中选择最佳溶剂分数和分析方法，或由实验设计定义。关键是要准备配方与最活跃的粗提取物和分数，并在复杂的模型上测试它们，以防止生物膜和腔的发展。

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General Pharmacological Principles

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

生产<em&gt;热带爪蟾</em&gt;卵提取物识别微管相关的RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

科研

生物学

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

定量检测，以研究蛋白质：DNA的相互作用，发现转录基因表达的调节，并确定新的抗肿瘤剂

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

捕获复合质谱 - 一个强大的工具来确定新型C-二GMP效应蛋白

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

沉默<em&gt; BRCA2</em&gt;以确定新的BRCA2调控的生物学功能在人体细胞培养

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

过程评价絮凝剂的效率的分散粒子的从植物提取物的去除

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

抗菌肽定位的细菌 Spheroplasts 和原生质体的生产与可视化

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

使用转基因钙处理器 Aequorin 前向基因屏幕，以识别钙信号中的新目标

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

分离高质量鼠心房和心室肌细胞，同时测量 Ca2+ 瞬变和 L 型钙电流

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

在靶标和标记下使用裂解分析植物中的H3K4me3修饰

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

使用斑马鱼鉴定色素沉着调节因子的反向遗传方法

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...