Name: systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries
Uploaded: 2021-03-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries at JoVE.com

Vi udtrykker vores taknemmelighed over for Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) fra Kemiinstituttet for UNESP, Araraquara/SP for at stille laboratorier til rådighed til udarbejdelse af plantemateriale. Vi takker også anvendt mikrobiologilaboratorium ved Institut for Dental Materials and Prosthodontics, UNESP, Araraquara/SP. Denne forskning blev støttet af et forskningstilskud fra São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600-3 til AJC) og stipendier plus faste midler (FAPESP #2017/07408-6 og FAPESP #2019/23175-7 til SMR; #2011/21440-3 og #2012/21921-4 til PCPB). Det nationale råd for videnskabelig og teknologisk udvikling ydede i samarbejde med FAPESP yderligere støtte (INCT CNPq #465637/2014-0 og FAPESP #2014/50926-0 til AJC).

1. Indsamling af plantemateriale
<ol><li>Plantemateriale<ol>
<li>Registrer adgangen til plantematerialet på elektroniske platforme, der regulerer adgangen til genetisk arv i det land, hvor samlingen skal finde sted. For eksempel i Brasilien skal du registrere dig hos det nationale system til forvaltning af genetisk arv og tilknyttet traditionel viden - SisGen (websted https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).</li>
		<li>Indsamle prøver af plantemateriale af interesse (f.eks blade, stilke, rødder, blomster, frugter)...

De største udfordringer i forbindelse med arbejdet med naturlige råekstrakter omfatter deres komplekse sammensætning og utilstrækkeligheden af klassiske biostyrede isolationsstudier. Selv om denne proces er langsom, er den effektiv og har ført til store resultater inden for NP-forskning. For at rationalisere er prioriteringsdrevne undersøgelser nødvendige for at rationalisere. Således er brugen af moderne kemiske profileringsmetoder til analyse af CE og dereplication før isolation vigtig for at karakterisere det...

De tidligste modeller af medicin, der anvendes i samfund, var baseret på naturlige produkter (NPs). Siden da har mennesker søgt efter nye kemikalier i naturen, der kan omdannes til stoffer1. Denne søgning medførte en løbende forbedring af teknologier og metoder til ethnobotanical screening1,2,3. NPs tilbyder en rig kilde til strukturelt forskellige stoffer, med en bred vifte af biologiske aktiviteter nyttige til udvikling af alternative eller adjuvans behandlinger. Den iboende komplekse plantematrix gør imidlertid isolering og identifikation af de aktive forbindelser til en udfordrende og tidskrævende opgave4.
NPs-baserede lægemidler eller formuleringer kan bruges til at forebygge og/eller behandle flere tilstande, der påvirker orale, herunder caries4. Caries, en af de mest udbredte kroniske sygdomme globalt, stammer fra samspillet mellem sukkerrig kost og mikrobielle biofilm (plak) dannet på tandoverfladen, der fører til demineralisering forårsaget af organiske syrer afledt af mikrobiel metabolisme, og hvis de ikke behandles, fører til tandtab5,6. Selv om andre mikroorganismer kan være forbundet7, Streptococcus mutans er en kritisk cariogen bakterie, fordi det er acidogen, aciduric, og en ekstracellulær matrix builder. Denne art koder flere exoenzymer (f.eks. glykosyltransferaser eller GTF'er), der bruger saccharose som substrat8 til at opbygge den ekstracellulære matrix, der er rig på exopolysaccharider, som er en virulensdeterminant9. Svampen Candida albicans kan også øge produktionen af den ekstracellulære matrix7. Selv om fluor, administreret i forskellige modaliteter, fortsat er grundlaget for at forebygge caries10, nye tilgange er nødvendige som adjuvanser for at øge dens effektivitet. Desuden er de tilgængelige antiplak-modaliteter baseret på brugen af bredspektret mikrobicidale midler (f.eks. chlorhexidin)11. Som et alternativ, NPs er potentielle behandlingsformer til kontrol af biofilm og forebyggelse af caries12,13.
Det yderligere fremskridt med opdagelsen af nye bioaktive forbindelser fra planter omfatter nødvendige skridt eller fremgangsmåder såsom: i) anvendelse af pålidelige og reproducerbare protokoller til prøveudtagning, idet planterne ofte udviser intraspecifik variation; ii) fremstilling af samlede ekstrakter og deres respektive fraktioner i lille målestok iii) karakteriseringen og/eller dereplicationen af deres kemiske profiler mente f.eks., at der var anskaffelse af flerdimensionale data såsom GC-MS, LC-DAD-MS eller NMR iv) anvendelse af levedygtige modeller med højt udbytte til vurdering af bioaktivitet v) udvælgelse af potentielle nye hits baseret på flerdimensional dataanalyse eller andre statistiske værktøjer vi) at foretage isolering og rensning af de målrettede forbindelser eller lovende kandidater og vii) validering af de tilsvarende biologiske aktiviteter ved hjælp af de isolerede forbindelser2,14.
Dereplication er processen med hurtigt at identificere kendte forbindelser i rå ekstrakt og giver mulighed for at skelne nye forbindelser fra dem, der allerede er blevet undersøgt. Desuden forhindrer denne proces isolation, når bioaktivitet allerede er beskrevet for visse forbindelser, og det er især nyttigt at opdage "hyppige hitters". Det har været brugt i forskellige ikke-målrettede arbejdsgange lige fra større sammensatte identifikation eller acceleration af aktivitetsstyret fraktionering op til den kemiske profilering af samlinger af ekstrakter. Det kan integreres fuldt ud med metabolomiske undersøgelser med henblik på ikke-målrettet kemisk profilering af CE eller målrettet identifikation af metabolitter. Alt dette fører i sidste ende til at prioritere uddrag før isolationsprocedurerne1,15,16,17.
Derfor beskriver vi i dette manuskript en systematisk tilgang til identifikation af antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraktioner. Det omfatter fire tværfaglige trin: 1) indsamling af plantemateriale; 2) fremstilling af råekstrakter (CE) og fraktioner (CEF) efterfulgt af deres kemiske profilanalyse 3) bioassays og 4) analyser af biologiske og kemiske data (figur 1). Således præsenterer vi den protokol, der er udviklet til at analysere casearia sylvestrisekstrakternes og fraktionernes antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter mod Streptococcus mutans og Candida albicans13, samt procedurerne for den fytokemiske karakterisering og dataanalyse. For nemheds skyld er fokus her at demonstrere tilgangen til screening af naturlige forbindelser ved hjælp af bakterien.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2.jpg"> Figur 1: Rutediagram over den systematiske metode til identifikation af aktive molekyler fra planteekstrakter og fraktioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplates&#160;</td>
			<td>Kasvi</td>
			<td>Flat bottom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated carbon</td>
			<td>LABSYNTH</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>Ika LabortechniK</td>
			<td>Model A11 Basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column C18</td>
			<td>Phenomenex Kinetex</td>
			<td>150 &#215; 2.1 mm, 2.6 &#181;m, 100&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate reader</td>
			<td>Biochrom Ez</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>GraphPad Prism7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (a freeze dryer)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>Modulyo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Millipore</td>
			<td>LAC</td>
			<td>0.22 &#181;m x 13 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>Model G816&#8201;M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamide solid phase extraction cartridge</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>40&#8211;63&#8201;&#956;m, 60&#8201;&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>0,89% in water</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase extraction cartridges (SPE)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC-DAD</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ultimate 3000 RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>UNIQUE</td>
			<td>Model USC 2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries

Naturlige produkter giver strukturelt forskellige stoffer med et utal af biologiske aktiviteter. Identifikation og isolering af aktive forbindelser fra planter er imidlertid udfordrende på grund af den komplekse plantematrix og tidskrævende isolations- og identifikationsprocedurer. Derfor præsenteres en trinvis tilgang til screening af naturlige forbindelser fra planter, herunder isolering og identifikation af potentielt aktive molekyler. Det omfatter indsamling af plantematerialet; tilberedning og fraktionering af råekstrakter; kromatografi og spektrometri (UHPLC-DAD-HRMS og NMR) metoder til analyse og identifikation af forbindelser bioassays (antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter; bakteriel "vedhæftningsstyrke" til spyt pellicle og indledende glucanmatrix behandlet med udvalgte behandlinger) og dataanalyse. Modellen er enkel, reproducerbar og giver mulighed for screening med høj gennemløb af flere forbindelser, koncentrationer og behandlingstrin kan kontrolleres konsekvent. De opnåede data danner grundlag for fremtidige undersøgelser, herunder formuleringer med de mest aktive ekstrakter og/eller fraktioner, isolering af molekyler, modellering af molekyler til specifikke mål i mikrobielle celler og biofilm. For eksempel er et mål at kontrollere cariogen biofilm at hæmme aktiviteten af Streptococcus mutans glucosyltransferaser, der syntetiserer den ekstracellulære matrix 'glucaner. Hæmning af disse enzymer forhindrer ophobning af biofilm, hvilket reducerer dens virulens.

Vi giver et eksempel på at bruge en systematisk tilgang til at screene den biologiske aktivitet af planteekstrakter og fraktioner for at identificere potentielt aktive molekyler til mulige nye anti-caries-behandlinger: antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter i Casearia sylvestris-ekstrakter fra forskellige brasilianske biomer mod Streptococcus mutans og Candida albicans13.
Baggrund Komplekse interaktioner mellem specifik...

Watch this Scientific Journal Video about Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries at JoVE.com

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Naturlige produkter udgør lovende udgangspunkter for udviklingen af nye lægemidler og terapeutiske midler. Men på grund af den høje kemiske mangfoldighed er det en udfordrende og tidskrævende opgave at finde nye terapeutiske forbindelser fra planter. Vi beskriver en forenklet tilgang til identifikation af antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraktioner.

Systematisk tilgang til identificering af nye antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planternes ekstrakter og fraktioner for at forhindre caries

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Den præsenterede protokol bruges til korrekt screening og analyse af bioaktive kandidater i naturlige produkter til at kontrollere orale biofilm. Det kan også tilpasses til applikationer inden for andre biofilmforskningsområder. Denne mest stivelsesscreenings- og analysemetode gør det muligt at fjerne bioaktive komponenter samtidigt.Caries er en biofilm kost afledt, meget udbredt, kronisk sygdom. Denne protokol kan hjælpe med at identificere naturlige produkter til at kontrollere biofilm og dermed caries. Begynd med at forberede ekstraktionsmiddel med en hydroalkoholisk blanding.Du prøver koncentrationer mellem 50 og 100 milligram pr. milliliter af ekstraktionsmiddelet og udfører 15-minutters ultralydassisterede ekstraktioner i mikrorør. Gentag udtrækningen tre gange. Efter hvert ekstraktionstrin centrifugeres prøven for at afskalle den faste rest og fjerne supernatanten.Kombiner supernatanterne fra hvert ekstraktionstrin og filtrer dem. Gem aliquots til kemisk analyse og bioassays. Til fraktionering fortyndes råekstraktprøven for at opnå en 100 milligram pr. milliliteropløsning ved hjælp af det oprindelige ekstraktionsmiddel.Derefter overføres en milliliter af denne prøve til en forkonditioneret massiv fase ekstraktionspatron med et gram absorbent og en kapacitet på seks milliliter. Udfør fraktionering ved hjælp af omkring tre døde bind af hver udtrækning LUN, og indsamle en brøkdel af LUN sammensætning. Gem aliquots til kemisk analyse og bioassays.Fjern opløsningsmidlet under vakuum, nitrogenstrøm eller lyofilisering, og registrer vægten og udbyttet. Rekonstruer tøroffet med de bedst mulige opløsningsmidler. Opløsningskoncentrationen for stamopløsningen beregnes ved hjælp af formlen i tekstmanuskriptet.Genaktivere mikrobielle stamme af S.mutans UA 159 på blod agar, og kultur det i flydende kultur medium. Udfør en 1 til 20 fortynding af den oprindelige kultur ved hjælp af det samme kulturmedium, og inkuber det, indtil det når mellemlogvækstfasen. Inoculumet forberedes med en defineret population i TYEG til antimikrobielle assays og TYE med 1% saccharose til biofilmanalyser.For antimikrobielle aktiviteter defineres koncentrationen af prøven til analyse, og den tilsættes til en 96-brønds plade. Medtag et sæt kontrolelementer i hver plade som beskrevet i tekstmanuskriptet. Ved hjælp af TYEG skal du justere lydstyrken til 100 mikroliter, vaccinere 100 mikroliter mikrobiel kultur og inkubere pladen i 24 timer ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid.Analyser bakterievæksten i henhold til uklarhed ved visuel inspektion af brøndene. Pod en aliquot af den ønskede fortynding i specifikke agarplader i dubletter og inkuber pladerne. Efter inkubationen skal du udføre kolonitællinger.Veje hydroxyapatitperler i mikrorør og sterilisere dem. Vask derefter perlerne ved hjælp af adsorptionsbuffer Ab.Add 500 mikroliter spyt i mikrorørene for at danne en spytfilm, og inkuber ved 37 grader Celsius med 24 rotationer i minuttet i 40 minutter. Fjern spyt supernatant og vask perlerne tre gange med Ab for at forberede dem til nedstrøms assays.Der tilsættes 500 mikroliter af prøven eller kontrollen til hvert mikrorør, der indeholder perler med spyt pellicle, og inkuber dem ved 24 rotationer i minuttet og 37 grader Celsius i 30 minutter. Vask perlerne tre gange med Ab.Add 500 mikroliter af mikrobiel kultur til hvert mikrorør, og inkuber rørene under lignende forhold i en time. Vask derefter de ubundne celler tre gange med Ab buffer.Genbrug hver prøve med en milliliter Ab buffer, og centicade ved syv Watt i 30 sekunder. Serielt fortyndet aliquots af hver suspension, ti gange, og plade dem på specifikke agar plader. Inkuber pladerne i 48 timer ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid, og tæl kolonierne.Til dataanalyse skal du indtaste de rå data for bioassays i et regneark og beregne loggen over mikrobiel væksthæmning ved hver behandling og logprocenten for mikrobiel væksthæmning sammenlignet med kontrollen. Ret den optiske tæthed af aflæsningerne, og beregn procentdelen af biomassehæmning. Den kemiske profil af biologisk screening for mængden af Clerodane-type diterpener og glycosylerede flavonoider i tre sorter af C.sylvestrisekstrakter, nemlig sylvestris, mellemliggende og lingua, er vist her.Efter analyse af de rå data viste fire uddrag en gunstig respons. De kromatografiske data for disse fire uddrag viser samtidig tilstedeværelse af Clerodane-type diterpener og glycosylerede flavonoider. Derudover omfatter de den samme biome og sort.Beregnet procent CFU af behandlede planktoniske celler, procent biomasse af de behandlede biofilm, og procent CFU af de behandlede biofilm er vist her. Ingen rå ekstrakt væsentligt påvirket fjernelsen af S.mutans celler overholdt spyt pellicle. Vedhæftningen af S.mutans celler til glucan matrix blev svækket af tre af de rå ekstrakter.Da hver planteart kræver optimerede og specifikke kemiske analysemetoder, skal den bedste opløsningsmiddelfraktion og analysemetode vælges blandt tidligere rapporter eller defineres ved forsøgsdesign. Det er afgørende at forberede formuleringer med de mest aktive rå ekstrakt og fraktioner og teste dem på komplekse modeller for at forhindre udviklingen af biofilm og hulrum.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

General Pharmacological Principles

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion af<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg uddragene Identificer mikrotubuli-associerede RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

En kvantitativ analyse til at studere Protein: DNA interaktioner, Discover transskriptionsregulatorer af genekspression, og identificere nye anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound massespektrometri - Et kraftfuldt værktøj til at identificere nye C-di-GMP effektorproteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing af<em&gt; BRCA2</em&gt; At identificere nye BRCA2-regulerede biologiske funktioner i dyrkede humane celler

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Procedure for at vurdere effektiviteten af ​​flokkuleringsmidler til fjernelse af dispergerede partikler fra planteekstrakter

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Produktion og visualisering af bakterielle Spheroplasts og Protoplasts til at karakterisere antimikrobielle peptid lokalisering

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward Genetiske Screen Brug Transgenic Calcium Reporter Aequorin at identificere nye mål i Calcium Signalering

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolering af murin atriale og ventrikulære myocytter af høj kvalitet til samtidige målinger afCa2+ transienter og L-type calciumstrøm

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Profilering af H3K4me3-modifikation i planter ved hjælp af spaltning under mål og tagmentering

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Omvendt genetisk tilgang til at identificere pigmentregulatorer ved hjælp af zebrafisk

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...