Name: systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries
Uploaded: 2021-03-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries at JoVE.com

Nous exprimons notre gratitude à Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) de l’Institut de chimie de l’UNESP, Araraquara/SP pour avoir fourni les laboratoires pour la préparation du matériel végétal. Nous remercions également le Laboratoire de microbiologie appliquée du Département des matériaux dentaires et de la prosthodontie, l’UNESP, Araraquara/SP. Cette recherche a été appuyée par une subvention de recherche de la São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600-3 à l’AJC) et des bourses d’études ainsi que des fonds généraux (FAPESP #2017/07408-6 et FAPESP #2019/23175-7 au SMR; #2011/21440-3 et #2012/21921-4 au PCPB). Le Conseil national du développement scientifique et technologique, en association avec la FAPESP, a apporté un soutien supplémentaire (INCT CNPq #465637/2014-0 et FAPESP #2014/50926-0 à l’AJC).

1. Collection de matériel végétal
<ol><li>Matériel végétal<ol>
<li>Enregistrez l’accès au matériel végétal sur des plateformes électroniques qui régulent l’accès au patrimoine génétique dans le pays où la collecte aura lieu. Par exemple, au Brésil, inscrivez-vous auprès du Système national pour la gestion du patrimoine génétique et des savoirs traditionnels associés – SisGen (site Web https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).</li>
		<li>Recueillir des échantillons du matériel végétal d?...

Les principaux défis liés au travail avec des extraits bruts naturels comprennent leur composition complexe et les insuffisances des études classiques d’isolement bioguidé. Bien que ce processus soit lent, il est efficace et a mené à des résultats majeurs dans la recherche sur les PN. Pour rationaliser, des études axées sur la hiérarchisation sont nécessaires pour rationaliser. Ainsi, l’utilisation d’approches modernes de profilage chimique pour l’analyse de l’EC et la redondant avant l’isolement s...

Les premiers modèles de médecine utilisés dans les sociétés étaient basés sur des produits naturels (PN). Depuis lors, les humains ont été à la recherche de nouveaux produits chimiques dans la nature qui peuvent être transformés enmédicaments 1. Cette recherche a entraîné une amélioration continue des technologies et des méthodes de dépistage ethnobotanique1,2,3. Les PN offrent une riche source de substances structurellement diversifiées, avec un large éventail d’activités biologiques utiles pour développer des thérapies alternatives ou adjuvantes. Toutefois, la matrice végétale complexe inhérente fait de l’isolement et de l’identification des composés actifs une tâche difficile et fastidieuse4.
Les médicaments ou formulations à base de PN peuvent être utilisés pour prévenir et/ou traiter plusieurs affections affectant l’oral, y compris les caries dentaires4. Caries dentaires, l’une des maladies chroniques les plus répandues dans le monde, dérive de l’interaction de l’alimentation riche en sucre et biofilms microbiens (plaque dentaire) formés sur la surface des dents qui conduit à la déminéralisation causée par des acides organiques dérivés du métabolisme microbien, et si elle n’est pas traitée, conduit à la perte dedents 5,6. Bien que d’autres micro-organismes puissentêtre associés 7, Streptococcus mutans est une bactérie cariogenic critique parce qu’elle est acidogène, acidurique, et un constructeur extracellulaire de matrice. Cette espèce code plusieurs exoenzymes (p. ex., glycosyltransferases ou Gtfs) qui utilisent le saccharose comme substrat8 pour construire la matrice extracellulaire riche en exopolysaccharides, qui sont un déterminant de la virulence9. En outre, le champignon Candida albicans peut conduire jusqu’à la production de cette matrice extracellulaire7. Bien que le fluorure, administré dans diverses modalités, reste la base pour prévenir les caries dentaires10, de nouvelles approches sont nécessaires comme adjuvants pour augmenter son efficacité. De plus, les modalités anti plaque disponibles sont fondées sur l’utilisation d’agents microbicides à large spectre (p. ex., chlorhexidine)11. Comme alternative, les PN sont des thérapies potentielles pour contrôler les biofilms et prévenir les cariesdentaires 12,13.
Les progrès supplémentaires réalisés dans la découverte de nouveaux composés bioactifs provenant de plantes comprennent les étapes ou les approches nécessaires telles que : (i) l’utilisation de protocoles fiables et reproductibles pour l’échantillonnage, étant donné que les plantes présentent souvent une variabilité intraspécifique; (ii) la préparation d’extraits complets et de leurs fractions respectives à petite échelle; iii) la caractérisation et/ou la dréplication de leurs profils chimiques pensaient à l’acquisition de données multidimensionnelles telles que GC-MS, LC-DAD-MS ou NMR, par exemple; iv) l’utilisation de modèles viables et à haut rendement pour évaluer la bioactivité; v) la sélection de nouveaux résultats potentiels basés sur une analyse multivariante des données ou d’autres outils statistiques; vi) d’effectuer l’isolement et la purification des composés ciblés ou des candidats prometteurs; et (vii) la validation des activités biologiques correspondantes à l’aide des composés isolés2,14.
La dréplication est le processus d’identification rapide des composés connus dans l’extrait brut et permet de différecier de nouveaux composés de ceux qui ont déjà été étudiés. En outre, ce processus empêche l’isolement lorsque la bioactivité a déjà été décrite pour certains composés, et il est particulièrement utile de détecter les « frappeurs fréquents ». Il a été utilisé dans différents flux de travail non ciblés allant de l’identification des composés majeurs ou l’accélération de la fractionnement guidé par l’activité jusqu’au profilage chimique des collections d’extraits. Il peut être entièrement intégré avec des études métabolomiques pour le profilage chimique non ciblé de ce ou l’identification ciblée des métabolites. Tout cela conduit finalement à hiérarchiser les extraits avant les procéduresd’isolement 1,15,16,17.
Par conséquent, dans le présent manuscrit, nous décrivons une approche systématique pour identifier les molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits végétaux et de fractions. Il comprend quatre étapes multidisciplinaires : (1) la collecte de matériel végétal; (2) la préparation d’extraits bruts (CE) et de fractions (CEF), suivie de leur analyse du profil chimique; (3) bioassays; et (4) les analyses de données biologiques et chimiques (figure 1). Ainsi, nous présentons le protocole développé pour analyser les activités antimicrobiennes et antibiofilms des extraits et fractions de Casearia sylvestris contre streptococcus mutans et candida albicans13, ainsi que les procédures de caractérisation phytochimique et d’analyse des données. Par souci de simplicité, l’objectif ici est de démontrer l’approche de dépistage des composés naturels à l’aide de la bactérie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2.jpg"> Figure 1 : Diagramme de flux de l’approche systématique pour identifier les molécules actives à partir d’extraits et de fractions de plantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplates&#160;</td>
			<td>Kasvi</td>
			<td>Flat bottom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated carbon</td>
			<td>LABSYNTH</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>Ika LabortechniK</td>
			<td>Model A11 Basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column C18</td>
			<td>Phenomenex Kinetex</td>
			<td>150 &#215; 2.1 mm, 2.6 &#181;m, 100&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate reader</td>
			<td>Biochrom Ez</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>GraphPad Prism7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (a freeze dryer)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>Modulyo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Millipore</td>
			<td>LAC</td>
			<td>0.22 &#181;m x 13 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>Model G816&#8201;M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamide solid phase extraction cartridge</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>40&#8211;63&#8201;&#956;m, 60&#8201;&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>0,89% in water</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase extraction cartridges (SPE)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC-DAD</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ultimate 3000 RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>UNIQUE</td>
			<td>Model USC 2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries

Les produits naturels fournissent des substances structurellement différentes, avec une myriade d’activités biologiques. Toutefois, l’identification et l’isolement des composés actifs par rapport aux plantes sont difficiles en raison de la matrice complexe des plantes et des procédures d’isolement et d’identification qui prennent beaucoup de temps. Par conséquent, une approche stepwise pour le criblage des composés naturels des usines, y compris l’isolement et l’identification des molécules potentiellement actives, est présentée. Il comprend la collecte du matériel végétal; préparation et fractionnement d’extraits bruts; les approches de chromatographie et de spectrométrie (UHPLC-DAD-HRMS et NMR) pour l’analyse et l’identification des composés; bioassays (activités antimicrobiennes et antibiofilms; « force d’adhérence » bactérienne à la pellicle salivaire et matrice de glucane initiale traitée avec des traitements sélectionnés); et l’analyse des données. Le modèle est simple, reproductible, et permet un criblage à haut débit de plusieurs composés, concentrations et étapes de traitement peuvent être constamment contrôlés. Les données obtenues fournissent les bases d’études futures, y compris des formulations avec les extraits et/ou fractions les plus actifs, l’isolement des molécules, la modélisation des molécules à des cibles spécifiques dans les cellules microbiennes et les biofilms. Par exemple, une cible pour contrôler le biofilm cariogenic est d’inhiber l’activité des glucosyltransferases de Streptococcus mutans qui synthétisent les glucanes de la matrice extracellulaire. L’inhibition de ces enzymes empêche l’accumulation de biofilm, diminuant sa virulence.

Nous fournissons un exemple d’utilisation d’une approche systématique pour examiner l’activité biologique des extraits et des fractions de plantes afin d’identifier des molécules potentiellement actives pour de nouvelles thérapies anti-caries possibles : activités antimicrobiennes et antibiofilms de Casearia sylvestris extraits de biomes brésiliens distincts contre streptocoques mutans et candida albicans13.
Fond...

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Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Les produits naturels représentent des points de départ prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments et agents thérapeutiques. Cependant, en raison de la grande diversité chimique, trouver de nouveaux composés thérapeutiques à partir des plantes est une tâche difficile et longue. Nous décrivons une approche simplifiée pour identifier les molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits de plantes et de fractions.

Approche systématique pour identifier les nouvelles molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits et de fractions de plantes pour prévenir les caries dentaires

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Le protocole présenté est utilisé pour le dépistage et l’analyse appropriés des candidats bioactifs dans les produits naturels pour contrôler les biofilms oraux. Il peut également être adapté pour des applications dans d’autres domaines de recherche de biofilm. Cette méthode de dépistage et d’analyse de la plupart des amidons permet d’éliminer simultanément les composants bioactifs.Caries dentaires est un régime biofilm dérivé, très répandue, maladie chronique. Ce protocole peut aider à identifier les produits naturels pour contrôler les biofilms et, par conséquent, les caries dentaires. Commencez par préparer le solvant d’extraction avec un mélange hydroalcoolique.Vous échantillonnez des concentrations comprises entre 50 et 100 milligrammes par millilitre du solvant d’extraction et effectuez des extractions assistées par ultrasons de 15 minutes dans des microtubes. Répétez l’extraction trois fois. Après chaque étape d’extraction, centrifugez l’échantillon pour décapiter les résidus solides et enlever le supernatant.Combinez les supernatants de chaque étape d’extraction et filtrez-les. Enregistrez les aliquots pour l’analyse chimique et les bioassays. Pour la fractionnement, diluer l’échantillon d’extrait brut pour obtenir une solution de 100 milligrammes par millilitre, à l’aide du solvant d’extraction initial.Ensuite, transférez un millilitre de cet échantillon à une cartouche d’extraction en phase solide conditionnée avec un gramme d’absorbant et une capacité de six millilitres. Effectuez la fractionnement, en utilisant environ trois volumes morts de chaque extraction LUN, et de recueillir une fraction par composition LUN. Économisez des aliquots pour l’analyse chimique et les bioassays.Enlevez le solvant sous vide, le flux d’azote ou la lyophilisation, et enregistrez le poids et le rendement. Reconstituer la matière sèche avec les meilleurs solvants possibles. Calculez la concentration de solvants pour la solution de stock, en utilisant la formule dans le manuscrit du texte.Réactiver la souche microbienne de S.mutans UA 159 sur l’agar sanguin, et la culture dans le milieu de culture liquide. Effectuez une dilution d’un à 20 de la culture initiale à l’aide du même milieu de culture et incubez-la jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase de croissance du milieu du rondin. Préparer l’inoculum avec une population définie dans TYEG pour les analyses anti-microbiennes et TYE avec 1% saccharose pour les analyses de biofilm.Pour l’activité anti-microbienne, définissez la concentration de l’échantillon pour analyse et ajoutez-le à une plaque de 96 puits. Inclure un ensemble de commandes dans chaque plaque, tel que décrit dans le manuscrit du texte. À l’aide du TYEG, réglez le volume à 100 microlitres, inoculez 100 microlitres de culture microbienne et incubez la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone à 5 %.Analyser la croissance bactérienne en fonction de la turbidité par inspection visuelle des puits. Inoculer un aliquot de la dilution désirée dans des plaques d’agar spécifiques en doublons, et incuber les plaques. Après l’incubation, effectuer le dénombrement des colonies.Pesez les perles d’hydroxyapatite dans les microtubes et stérilisez-les. Ensuite, lavez les perles, à l’aide de tampon d’adsorption Ab.Ajouter 500 microlitres de salive dans les microtubes pour former un film salivaire, et incuber à 37 degrés Celsius avec 24 rotations par minute pendant 40 minutes. Retirer le surnatant salivaire et laver les perles trois fois avec Ab pour les préparer aux analyses en aval.Ajouter 500 microlitres de l’échantillon ou le contrôle dans chaque microtube contenant des perles avec pellicle salivaire, et les incuber à 24 rotations par minute et 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Lavez les perles trois fois avec Ab.Add 500 microlitres de culture microbienne à chaque microtube, et incuber les tubes dans des conditions similaires pendant une heure. Ensuite, lavez les cellules non liées trois fois avec ab tampon.Resuspendez chaque échantillon avec un millilitre de tampon Ab, et centicade à sept watts pendant 30 secondes. Diluer en série les aliquots de chaque suspension, décupler, et les plaquer sur des plaques d’agar spécifiques. Incuber les plaques pendant 48 heures à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5%, et compter les colonies.Pour l’analyse des données, entrez les données brutes pour les bioassays dans une feuille de calcul, et calculez le journal de l’inhibition de croissance microbienne par chaque traitement, et le pourcentage de journal de l’inhibition de croissance microbienne, par rapport au contrôle. Corrigez la densité optique des lectures et calculez le pourcentage d’inhibition de la biomasse. Le profil chimique du dépistage biologique de la quantité de diterpenes de type Clerodane et de flavonoïdes glycoylés dans trois variétés d’extraits de C.sylvestris, à savoir sylvestris, intermédiaire et lingua, sont présentés ici.Après analyse des données brutes, quatre extraits ont montré une réponse favorable. Les données chromatographic de ces quatre extraits montrent la présence simultanée des diterpenes clerodane-type et des flavonoïdes glycoylated. En outre, ils comprennent le même biome et la variété.Le pourcentage calculé de CFU des cellules planctoniques traitées, la biomasse en pourcentage des biofilms traités, et pour cent de CFU du biofilm traité sont montrés ici. Aucun extrait brut n’a affecté de manière significative l’enlèvement des cellules de S.mutans adhéré au pellicle salivaire. L’adhérence des cellules S.mutans à la matrice glucane a été affaiblie par trois des extraits bruts.Étant donné que chaque espèce végétale nécessite des méthodes d’analyse chimique optimisées et spécifiques, la meilleure fraction de solvant et la meilleure méthode analytique doivent être sélectionnées à partir de rapports antérieurs ou définies par conception expérimentale. Il est essentiel de préparer des formulations avec l’extrait brut le plus actif et les fractions et de les tester sur des modèles complexes pour empêcher le développement de biofilms et de cavités.

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