Name: systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries
Uploaded: 2021-03-31T12:30:00
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植物材料の製造研究所を提供してくれたアララクアラ/SPのUNESP化学研究所のヌクレオ・デ・バイオレジオジオス、バイオスシンテーゼ・エ・エコフィシオロジア・デ・プロドゥトス・ナチュラワ(NuBBE)に感謝の意を表します。また、アララクアラ/SPの歯学・補生学科応用微生物学研究室に感謝します。この研究は、サンパウロ研究財団(FAPESP #2013/07600-3からAJC)の研究助成金と、奨学金に加えてオーバーヘッド資金(FAPESP #2017/07408-6およびFAPESP #2019/23175-7からSMR #2012 #2011への研究助成金によって支えられました。FAPESPに関連する国家科学技術開発評議会は追加の支援を提供しました(INCT CNPq #465637/2014-0およびFAPESP #2014/50926-0をAJCに)。

1. 植物材料の回収
<ol><li>植物材料<ol>
<li>コレクションが行われる国の遺伝的遺産へのアクセスを規制する電子プラットフォーム上の植物材料へのアクセスを記録します。例えば、ブラジルでは、遺伝的遺産と関連する伝統的知識の管理のための国家システムに登録する - SisGen (ウェブサイト https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx)。</li>
		<li>目的の植物材料(例えば、葉、茎、根、花、果実)のサンプ?...

天然の粗抽出物の研究に関連する主な課題は、その複雑な組成と古典的な生体誘導分離研究の不十分さから成り立っています。このプロセスは遅いですが,効果的であり,NP研究における主要な知見につながっています。合理化には、優先順位付け主導型の研究が必要です。したがって、分離前のCEおよび非複製の分析のための現代の化学プロファイリングアプローチの使用は、研究された材料?...

社会で使用される医学の最も初期のモデルは、天然物(NP)に基づいていました。それ以来、人間は、薬物1に変換することができる自然界の新しい化学物質を探しています。この探索は、民族植物スクリーニング1、2、3の技術と方法の継続的な改善を引き起こした。NPは構造的に多様な物質の豊富な供給源を提供し、代替療法やアジュバント療法の開発に役立つ幅広い生物学的活動を提供しています。しかし、固有の複雑な植物マトリックスは、活性化合物の分離と同定を困難で時間のかかる作業4にします。
NPsベースの薬物または製剤は、口腔に影響を与えるいくつかの状態を予防および/または治療するために使用することができます, 歯科用虫歯を含む4.世界的に最も流行している慢性疾患の一つである齲蝕は、糖が豊富な食生活と微生物のバイオフィルム(歯垢)の相互作用に由来し、歯面に形成され、微生物代謝に由来する有機酸によって生じる脱灰化につながり、治療しなければ、歯の損失5,6を引き起こす。他の微生物は7を関連付けてもよいが、ストレプトコッカス変異体は、酸性、酸尿、および細胞外マトリックスビルダーであるため、重要な発膜性細菌である。本種は、ショ糖を基質8として使用する複数のエキソ酵素(例えば、グリコシルトランスファーゼまたはGtfs)をコードし、細胞外多糖を豊富に含む細胞外マトリックスを構築し、これは毒性決定基9である。また、カンディダ・アルビカンス菌は、その細胞外マトリックス7の産生を促進することができる。フッ化物は、様々なモダリティで投与されるが、齲蝕10を予防するための基礎であり続け、その有効性を高めるために補助剤として新しいアプローチが必要である。また、利用可能な抗プラークモダクティビティは、広域スペクトル微小bicidal剤(例えば、クロルヘキシジン)11の使用に基づいている。代替として、NPはバイオフィルムを制御し、歯の齲蝕12、13を防ぐための潜在的な治療法です。
植物からの新しい生理活性化合物の発見のさらなる進歩には、(i)植物がしばしば特異性の内在性を示すことを考慮して、サンプリングのための信頼性の高い再現可能なプロトコルの使用のような必要なステップまたはアプローチが含まれます。(ii) 小規模での包括的抽出物およびそれぞれの分画の調製。(iii) それらの化学プロファイルの特性評価および/または非複製は、GC-MS、LC-DAD-MS、またはNMRなどの多次元データの取得を考えた。(iv) 生物活性を評価するための実行可能で高収率モデルの使用。(v) 多変量データ分析またはその他の統計ツールに基づく潜在的な新しいヒットの選択。(vi)標的化合物または有望な候補の単離および精製を行う。(vii)単離化合物2,14を用いた対応した生物学的活性の検証。
デレプリケーションは、粗抽出物中の既知の化合物を迅速に同定するプロセスであり、既に研究されているものとは新しい化合物を区別することを可能にする。また、このプロセスは、生物活性が特定の化合物について既に記述されている場合の単離を防ぎ、「頻繁な打者」を検出するのに特に有用である。これは、主要な化合物同定または活動誘導分画の加速から抽出物のコレクションの化学プロファイリングまで、さまざまなターゲットを絞られていないワークフローで使用されています。CEの非標的化学プロファイリングまたは代謝産物の標的同定のためのメタボロミック研究と完全に統合することができる。このすべては、最終的に分離手順1、15、16、17の前に抽出物の優先順位付けにつながります。
そこで本稿では、植物抽出物および画分から抗菌分子および抗菌膜分子を同定するための体系的なアプローチを述べる。それは4つの学際的なステップを含んでいる:(1)植物材料のコレクション;(2)粗抽出物(CE)および分数(CEF)の調製、その後の化学プロファイル分析;(3) バイオアッセイ(4)生物・化学データ分析(図1)。そこで、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびカンジダ・アルビカンス13に対するカゼリアシルヴェストリス抽出物および画分の抗菌・抗バイオフィルム活動を分析するために開発されたプロトコルと、植物化学的特性解析とデータ分析の手順を提示する。簡単にするために、ここでの焦点は、細菌を使用して天然化合物をスクリーニングするためのアプローチを実証することです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2.jpg"> 図1:植物抽出物と分画から活性分子を同定する系統的アプローチのフローチャート。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplates&#160;</td>
			<td>Kasvi</td>
			<td>Flat bottom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated carbon</td>
			<td>LABSYNTH</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>Ika LabortechniK</td>
			<td>Model A11 Basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column C18</td>
			<td>Phenomenex Kinetex</td>
			<td>150 &#215; 2.1 mm, 2.6 &#181;m, 100&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate reader</td>
			<td>Biochrom Ez</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>GraphPad Prism7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (a freeze dryer)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>Modulyo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Millipore</td>
			<td>LAC</td>
			<td>0.22 &#181;m x 13 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>Model G816&#8201;M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamide solid phase extraction cartridge</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>40&#8211;63&#8201;&#956;m, 60&#8201;&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>0,89% in water</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase extraction cartridges (SPE)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC-DAD</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ultimate 3000 RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>UNIQUE</td>
			<td>Model USC 2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries

天然物は、構造的に異なる物質を提供し、無数の生物学的活動を提供します。しかし、植物からの活性化合物の同定と分離は、複雑な植物マトリックスと時間のかかる分離および同定手順のために困難です。そこで、潜在的に活性な分子の単離および同定を含む植物由来の天然化合物をスクリーニングするための段階的アプローチが提示される。それは植物材料のコレクションを含みます。粗抽出物の調製と分画;クロマトグラフィーおよび分光法(UHPLC-DAD-HRMSおよびNMR)の分析および化合物同定のためのアプローチ;バイオアッセイ(抗菌および抗バイオフィルム活性;選択された治療で治療された唾液ペリクルおよび初期グルカンマトリックスへの細菌の「接着強度」);データ分析を行います。モデルは簡単で、再生可能で、複数の化合物、濃度および処置ステップのハイスループットスクリーニングを一貫して制御することができる。得られたデータは、最も活性な抽出物および/または画分を含む製剤、分子の単離、微生物細胞およびバイオフィルム内の特定の標的への分子のモデリングを含む、将来の研究のための基礎を提供する。例えば、齲蝕原性バイオフィルムを制御する1つの標的は、細胞外マトリックスのグルカンを合成する レンサ球菌変異体 グルコシルトランスファーーゼの活性を阻害するものである。これらの酵素の阻害は、バイオフィルムの蓄積を防ぎ、その毒性を低下させる。

我々は、植物抽出物および分画の生物学的活性をスクリーニングする体系的なアプローチを用いて、新しい抗齲虫療法の可能性のある活性分子を同定する例を提供する:ストレプトコッカス・ミュータンスおよびカンジダ・アルビカンス13に対するブラジルの異なるバイオームからのカゼリアシルベストリス抽出物の抗菌および抗バイオフィルム活性。...

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Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

天然物は、新薬および治療薬の開発の有望な出発点を表しています。しかし、化学的多様性が高いため、植物から新しい治療化合物を見つけることは困難で時間のかかる作業です。植物抽出物および分画から抗菌分子および抗バイオフィルム分子を同定するための簡便なアプローチを説明する。

植物の抽出物と分率から新しい抗菌分子と抗バイオフィルム分子を同定し、齲蝕を予防する体系的アプローチ

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

提示されたプロトコルは、経口バイオフィルムを制御するために、天然物の生理活性候補を正しくスクリーニングし、分析するために使用されます。また、他のバイオフィルム研究分野での応用にも適応できます。この最も澱粉のスクリーニングおよび分析方法は、同時に生理活性成分を除去することを可能にする。虫歯は、バイオフィルムダイエット由来、非常に流行、慢性疾患である。このプロトコルは、バイオフィルムを制御し、その結果、虫歯を制御するために天然物を識別するのに役立ちます。まず、抽出溶媒を水性アルコール混合物で調製する。抽出溶媒のミリリットル当たり50〜100ミリグラムの濃度をサンプリングし、マイクロチューブで15分間の超音波補助抽出を行います。抽出を3回繰り返します。各抽出工程の後、遠心分離して試料を遠心し、固体残渣を脱キャップし、上清を除去する。各抽出ステップから上清を組み合わせて、それらをフィルタリングします。化学分析とバイオアッセイのためのアリコートを保存します。分画については、粗抽出試料を希釈し、初期抽出溶媒を用いて1ミリリットル溶液あたり100ミリグラムを得る。次に、このサンプルの1ミリリットルを、吸収剤の1グラムと6ミリリットルの容量を備えた予条件固相抽出カートリッジに移します。各抽出LUNの約3つのデッドボリュームを使用して分画を行い、LUN構成によって1分数を収集します。化学分析とバイオアッセイのためのアリコートを保存します。真空、窒素流、または凍結乾燥の下で溶媒を除去し、重量と収率を登録します。可能な限り最良の溶媒で乾燥物質を再構成します。テキスト原稿の式を使用して、ストック溶液の溶媒濃度を計算します。血寒天上のS.mutans UA 159の微生物株を再活性化し、液体培養培地で培養する。同じ培養培地を用いて初期培養液の1~20希釈を行い、中対成長期に達するまでインキュベートする。抗菌アッセイ用のTYEGと、バイオフィルムアッセイ用の1%スクロースを使用してTYEEで定義された集団を使用して接種を準備します。抗菌活性については、分析用のサンプル濃度を定義し、それを96ウェルプレートに加えます。テキスト原稿に記載されているように、各版に一連のコントロールを含めます。TYEGを使用して、体積を100マイクロリットルに調整し、100マイクロリットルの微生物培養液を接種し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間プレートをインキュベートします。井戸の目視検査により濁度に応じて細菌の増殖を分析します。特定の寒天プレート中の目的の希釈液のアリコートを重複して接種し、プレートをインキュベートする。インキュベーション後、コロニーカウントを行う。マイクロチューブでヒドロキシアパタイトビーズの重量を量り、それらを殺菌します。次にビーズを洗浄し、吸着バッファーAb.を使用して500マイクロリットルの唾液をマイクロチューブに加えて唾液膜を形成し、40分間毎分24回転で摂氏37度でインキュベートする。唾液上清を取り除き、ビーズをAbで3回洗い、下流アッセイに備えます。唾液ペリクルのビーズを含む各マイクロチューブにサンプルまたはコントロールの500マイクロリットルを加え、毎分24回転、摂氏37度で30分間インキュベートします。各マイクロチューブに500マイクロリットルの微生物培養液を加え、同様の条件で1時間チューブをインキュベートして、ビーズを3回洗浄します。次いで、非結合細胞をAbバッファーで3回洗浄します。各サンプルを1ミリリットルのAbバッファで再中断し、センカデを7ワットで30秒間再中断します。各懸濁液のアリコートを10倍に連続して希釈し、特定の寒天プレートにプレートします。5%の二酸化炭素で摂氏37度で48時間プレートをインキュベートし、コロニーを数えます。データ解析のために、バイオアッセイの生データをスプレッドシートに入力し、各処理による微生物増殖阻害のログを計算し、微生物増殖阻害の対数割合を制御と比較した。測定値の光学密度を補正し、バイオマス阻害率を計算します。C.シルヴェストリス抽出物、すなわちシルヴェストリス、中間体、およびリングアの3種類のクレロダン型ジテルペンおよびグリコシル化フラボノイドの量に対する生物学的スクリーニングの化学的プロファイルをここに示す。生データの分析後、4つの抽出物が好ましい反応を示した。これら4つの抽出物のクロマトグラフィーデータは、クレロダン型ジテルペンとグリコシル化フラボノイドの同時存在を示す。さらに、それらは同じバイオームおよび多様性を含む。処理されたプランクトニック細胞のCFUパーセント、処理されたバイオフィルムのバイオマスのパーセント、および処理されたバイオフィルムのパーセントCFUをここに示す。唾液ペリクルに付着したS.mutans細胞の除去に有意に影響を与える粗抽出物はなかった。グルカンマトリックスへのS.mutans細胞の接着は、3つの粗抽出物によって弱まった。各植物種は最適化された特定の化学分析方法を必要とするため、最良の溶媒分数および分析方法は、以前のレポートから選択するか、実験計画によって定義する必要があります。最も活性な粗抽出物と分数を用いて製剤を調製し、複雑なモデルでテストしてバイオフィルムやキャビティの開発を防ぐことが重要です。

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Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

の生産<em&gt;アフリカツメガエルトロピカ</em微小管関連RNAを識別するために、&gt;卵抽出

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

生物学

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

捕獲化合物質量分析 - 小説のc-ジ-GMPエフェクタータンパク質を同定するための強力なツール

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

のサイレンシング<em&gt; BRCA2</em&gt;ヒト培養細胞における新規BRCA2-調節される生物学的機能を同定するために、

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

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生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

トランスジェニックカルシウムレポーターエークオリンを用いたニューシグナル伝達の新しい標的の同定を用いた遺伝子スクリーンの前方

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるH3K4me3修飾のプロファイリング

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Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

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