Name: systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries
Uploaded: 2021-03-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries at JoVE.com

Vi uttrycker vår tacksamhet till Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) vid Kemiinstitutet i UNESP, Araraquara/SP för att ha tillhandahållit laboratorierna för beredning av växtmaterial. Vi tackar också Applied Microbiology Laboratory vid institutionen för tandmaterial och prostodonti, UNESP, Araraquara/SP. Denna forskning stöddes av ett forskningsanslag från São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600–3 till AJC) och stipendier plus overheadfonder (FAPESP #2017/07408–6 och FAPESP #2019/23175–7 till SMR; #2011/21440–3 och #2012/21921–4 till PCPB). Det nationella rådet för vetenskaplig och teknisk utveckling i samarbete med FAPESP gav ytterligare stöd (INCT CNPq #465637/2014–0 och FAPESP #2014/50926–0 till AJC).

1. Insamling av växtmaterial
<ol><li>Växtmaterial<ol>
<li>Registrera tillgången till växtmaterialet på elektroniska plattformar som reglerar tillgången till genetiskt arv i det land där samlingen kommer att äga rum. I Brasilien registrerar du dig till exempel hos det nationella systemet för hantering av genetiskt arv och tillhörande traditionell kunskap – SisGen (https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).</li>
		<li>Samla prover av växtmaterialet av intresse (t.ex. löv, stjälkar, rötter, blommor, frukte...

De största utmaningarna i samband med arbetet med naturliga råextrakt är deras komplexa sammansättning och bristerna i klassiska biostyrda isoleringsstudier. Även om denna process är långsam är den effektiv och har lett till stora resultat i NP-forskning. För att rationalisera behövs prioriteringsdrivna studier för att rationalisera. Således är användningen av moderna kemiska profileringsmetoder för analys av CE och dereplication före isolering viktigt för att karakterisera det studerade materialet och s...

De tidigaste läkemedelsmodellerna som används i samhällen baserades på naturliga produkter.The earliest models of medicine used in societies were based on natural products (NPs). Sedan dess har människor letat efter nya kemikalier i naturen som kan omvandlas till droger1. Denna sökning orsakade en kontinuerlig förbättring av teknik och metoder för etnobotanisk screening1,2,3. NPs erbjuder en rik källa till strukturellt olika ämnen, med ett brett utbud av biologiska aktiviteter som är användbara för att utveckla alternativa eller adjuvanta terapier. Den inneboende komplexa växtmatrisen gör dock isoleringen och identifieringen av de aktiva föreningarna till en utmanande och tidskrävande uppgift4.
NPs-baserade läkemedel eller formuleringar kan användas för att förebygga och/eller behandla flera tillstånd som påverkar orala, inklusive karies4. Karies, en av de vanligaste kroniska sjukdomarna globalt, härrör från interaktionen mellan sockerrik kost och mikrobiella biofilmer (dental plack) som bildas på tandytan som leder till demineralisering orsakad av organiska syror som härrör från mikrobiell metabolism, och om den inte behandlas, leder till tandförlust5,6. Även om andra mikroorganismer kan associeras7, är Streptococcus mutans en kritisk kariogen bakterie eftersom den är surogen, sur och en extracellulär matrisbyggare. Denna art kodar för flera exoenzymer (t.ex. glykosyltransferaser eller gtfs) som använder sackaros som substrat8 för att bygga den extracellulära matrisen rik på exopolysackarider, som är en virulensbestämandefaktor 9. Svampen Candida albicans kan också driva upp produktionen av den extracellulära matrisen7. Även om fluor, administreras i olika former, förblir grunden för att förhindra karies10, behövs nya metoder som adjuvanser för att öka dess effektivitet. Dessutom är de tillgängliga antiplackmodaliteterna baserade på användning av bredspektrummikrobicida medel (t.ex. klorhexidin)11. Som ett alternativ är NPs potentiella terapier för att kontrollera biofilmer och förebygga karies12,13.
De ytterligare framstegen i upptäckten av nya bioaktiva föreningar från växter omfattar nödvändiga steg eller metoder såsom i) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med tanke på att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med beaktande av att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med beaktande av att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med beaktande av att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med beaktande av att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) Beredning av omfattande extrakt och deras respektive fraktioner i liten skala. iii) Karakteriseringen och/eller derepliceringen av deras kemiska profiler, t.ex. iv) Användning av livskraftiga modeller och högavkastande modeller för att bedöma bioaktivitet. v) Urval av potentiella nya träffar på grundval av multivariat dataanalys eller andra statistiska verktyg. vi) att utföra isolering och rening av de målinriktade föreningarna eller de lovande kandidaterna, och vii) validering av de motsvarade biologiska aktiviteterna med hjälp av de isoleradeföreningarna 2,14.
Dereplication är processen att snabbt identifiera kända föreningar i råextrakt och tillåter differentiering av nya föreningar från de som redan har studerats. Dessutom förhindrar denna process isolering när bioaktivitet redan har beskrivits för vissa föreningar, och det är särskilt användbart att upptäcka "frekventa hitters". Det har använts i olika oberiktade arbetsflöden som sträcker sig från större sammansatt identifiering eller acceleration av aktivitetsstyrd fraktionering fram till kemisk profilering av samlingar av extrakt. Det kan integreras helt med metabolomiska studier för obeladda kemiska profilering av CE eller riktad identifiering av metaboliter. Allt detta leder slutligen till att prioritera extrakt före isoleringsförfarandena1,15,16,17.
Därför beskriver vi i det nuvarande manuskriptet ett systematiskt tillvägagångssätt för att identifiera antimikrobiella och antibiofilmmolekyler från växtextrakt och fraktioner. Den innehåller fyra tvärvetenskapliga steg: (1) insamling av växtmaterial; 2. Beredning av råextrakt (CE) och fraktioner (FSE), följt av deras kemiska profilanalys. 3. Bioassays. och (4) biologiska och kemiska dataanalyser (figur 1). Således presenterar vi protokollet utvecklat för att analysera de antimikrobiella och antibiofilm aktiviteterna i Casearia sylvestris extrakt och fraktioner mot Streptococcus mutans och Candida albicans13, liksom förfarandena för fytokemisk karakterisering och dataanalys. För enkelhetens skull är fokus här att demonstrera tillvägagångssättet för screening av naturliga föreningar med hjälp av bakterien.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2.jpg"> Figur 1: Flödesschema över det systematiska tillvägagångssättet för att identifiera aktiva molekyler från växters extrakt och fraktioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplates&#160;</td>
			<td>Kasvi</td>
			<td>Flat bottom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated carbon</td>
			<td>LABSYNTH</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>Ika LabortechniK</td>
			<td>Model A11 Basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column C18</td>
			<td>Phenomenex Kinetex</td>
			<td>150 &#215; 2.1 mm, 2.6 &#181;m, 100&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate reader</td>
			<td>Biochrom Ez</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Vehicle solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>GraphPad Prism7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>Fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>For extraction step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (a freeze dryer)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>Modulyo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Millipore</td>
			<td>LAC</td>
			<td>0.22 &#181;m x 13 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>Model G816&#8201;M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamide solid phase extraction cartridge</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>40&#8211;63&#8201;&#956;m, 60&#8201;&#194;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>0,89% in water</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase extraction cartridges (SPE)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>Clean up and/or fractionation step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC-DAD</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ultimate 3000 RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>UNIQUE</td>
			<td>Model USC 2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systematic approach to identify novel antimicrobial and antibiofilm molecules from plants' extracts and fractions to prevent dental caries

Naturliga produkter ger strukturellt olika ämnen, med en myriad av biologiska aktiviteter. Identifiering och isolering av aktiva föreningar från växter är dock utmanande på grund av den komplexa växtmatrisen och tidskrävande isolerings- och identifieringsförfaranden. Därför presenteras ett stegvis tillvägagångssätt för screening av naturliga föreningar från växter, inklusive isolering och identifiering av potentiellt aktiva molekyler. Det inkluderar insamling av växtmaterialet; Beredning och fraktionering av råextrakt. Metoder för kromatografi och spektrometri (UHPLC-DAD-HRMS och NMR) för analys och identifiering av föreningar. Bioassays (antimikrobiella och antibiofilmsaktiviteter; bakteriell "vidhäftningsstyrka" till saliv pellikeln och den ursprungliga glukanmatrisen som behandlats med utvalda behandlingar). och dataanalys. Modellen är enkel, reproducerbar och möjliggör screening med hög genomströmning av flera föreningar, koncentrationer och behandlingssteg kan kontrolleras konsekvent. De erhållna uppgifterna utgör grunden för framtida studier, inklusive formuleringar med de mest aktiva extrakten och/eller fraktionerna, isolering av molekyler, modelleringsmolekyler till specifika mål i mikrobiella celler och biofilmer. Ett mål för att kontrollera kariogen biofilm är till exempel att hämma aktiviteten hos Streptococcus mutans glukosyltransferaser som syntetiserar den extracellulära matrisens glukaner. Hämningen av dessa enzymer förhindrar biofilmuppbyggnaden, vilket minskar dess virulens.

Vi ger ett exempel på att använda ett systematiskt tillvägagångssätt för att screena den biologiska aktiviteten hos växtextrakt och fraktioner för att identifiera potentiellt aktiva molekyler för möjliga nya kariesbehandlingar: antimikrobiella och antibiofilmaktiviteter av Casearia sylvestris extrakt från distinkta brasilianska biomer mot Streptococcus mutans och Candida albicans13.
Bakgrund Komplexa interaktione...

Watch this Scientific Journal Video about Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries at JoVE.com

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Naturliga produkter utgör lovande utgångspunkter för utveckling av nya läkemedel och terapeutiska medel. Men på grund av den höga kemiska mångfalden är det en utmanande och tidskrävande uppgift att hitta nya terapeutiska föreningar från växter. Vi beskriver ett förenklat tillvägagångssätt för att identifiera antimikrobiella och antibiofilm molekyler från växt extrakt och fraktioner.

Systematiskt tillvägagångssätt för att identifiera nya antimikrobiella och antibiofilmmolekyler från växters extrakt och fraktioner för att förhindra karies

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Det presenterade protokollet används för korrekt screening och analys av bioaktiva kandidater i naturliga produkter för att kontrollera orala biofilmer. Den kan också anpassas för tillämpningar inom andra biofilmsforskningsområden. Denna mest stärkelse screening och analysmetod gör det möjligt att ta bort bioaktiva komponenter samtidigt.Karies är en biofilm diet härledd, mycket utbredd, kronisk sjukdom. Detta protokoll kan bidra till att identifiera naturliga produkter för att kontrollera biofilmer och följaktligen karies. Börja med att förbereda extraktionsmedel med en hydroalkoholblandning.Du provar koncentrationer mellan 50 och 100 milligram per milliliter extraktionsmedel och utför 15-minuters ultraljudsassisterade extraktioner i mikrorör. Upprepa extraktionen tre gånger. Efter varje extraktionssteg, centrifugera provet för att halshugga de fasta resterna och ta bort supernatanten.Kombinera supernatanterna från varje extraktionssteg och filtrera dem. Spara alikvoterna för kemisk analys och bioassays. För fraktionering, späd råextraktprovet för att erhålla en 100 milligram per milliliterlösning med hjälp av det ursprungliga extraktionsmedel.Överför sedan en milliliter av detta prov till en förkonditionerad fastfasutsugningspatron med ett gram absorbent och en kapacitet på sex milliliter. Utför fraktionering med hjälp av cirka tre döda volymer av varje extraktions LUN och samla in en fraktion med LUN-komposition. Spara alikvoter för kemisk analys och bioassays.Ta bort lösningsmedlet under vakuum, kväveflöde eller lyofilisering och registrera vikten och utbytet. Rekonstruera torrsubstansen med bästa möjliga lösningsmedel. Beräkna lösningsmedelskoncentrationen för stamlösningen med hjälp av formeln i textmanuskriptet.Återaktivera den mikrobiella stammen av S.mutans UA 159 på blodagar och odla den i flytande odlingsmedium. Utför en en till 20 utspädning av den ursprungliga kulturen med samma odlingsmedium och inkubera den tills den når tillväxtfasen mitt i stocken. Förbered inokulat med en definierad population i TYEG för antimikrobiella analyser och TYE med 1%sackaros för biofilmsanalyser.För antimikrobiell aktivitet, definiera koncentrationen av provet för analys och tillsätt det till en 96-brunnsplatta. Inkludera en uppsättning kontroller i varje tallrik, enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Använd TYEG, justera volymen till 100 mikroliter, inokulera 100 mikroliter mikrobiell kultur och inkubera plattan i 24 timmar vid 37 grader Celsius i 5% koldioxid.Analysera bakterietillväxten enligt grumlighet genom visuell inspektion av brunnarna. Inokulera en alikvot av önskad utspädning i specifika agarplattor i dubbletter och inkubera plattorna. Efter inkubationen, utför koloniräkningar.Väg hydroxiapatitpärlor i mikrorör och sterilisera dem. Tvätta sedan pärlorna med adsorptionsbuffert ab.addera 500 mikroliter saliv i mikrorören för att bilda en salivfilm och inkubera vid 37 grader Celsius med 24 rotationer per minut i 40 minuter. Ta bort salivens supernatant och tvätta pärlorna tre gånger med Ab för att förbereda dem för nedströmsanalyser.Tillsätt 500 mikroliter av provet eller kontrollen i varje mikrorör som innehåller pärlor med salivär pellicle och inkubera dem vid 24 rotationer per minut och 37 grader Celsius i 30 minuter. Tvätta pärlorna tre gånger med Ab.Add 500 mikroliter mikrobiell kultur till varje mikrorör och inkubera rören under liknande förhållanden i en timme. Tvätta sedan de obundna cellerna tre gånger med Ab-buffert.Återanvänd varje prov med en milliliter Ab-buffert och centikad vid sju watt i 30 sekunder. Späd ut alikvoter av varje suspension, tiofaldigt, och plätera dem på specifika agarplattor. Inkubera plattorna i 48 timmar vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid och räkna kolonierna.För dataanalys mata in rådata för bioassays i ett kalkylblad och beräkna loggen för mikrobiell tillväxthämning genom varje behandling och loggprocenten av mikrobiell tillväxthämning, jämfört med kontrollen. Korrigera avläsningens optiska densitet och beräkna andelen biomassahämning. Den kemiska profilen av biologisk screening för mängden Clerodane-typ diterpener och glykosylerade flavonoider i tre sorter av C.sylvestris extrakt, nämligen sylvestris, mellanliggande och lingua, visas här.Efter analys av rådata visade fyra extrakt ett gynnsamt svar. Kromatografiska data av dessa fyra extrakt visar samtidig närvaro av Clerodane-typ diterpenes och glykosylerade flavonoider. Dessutom innehåller de samma biome och sort.Beräknad procent CFU av behandlade planktoniska celler, procent biomassa av de behandlade biofilmerna och procent CFU av den behandlade biofilmen visas här. Inget råextrakt påverkade avsevärt avlägsnandet av S.mutans celler klibbade på salivary pellicle. Vidhäftningen av S.mutans celler till glucan matrisen försvagades av tre av de råa extrakten.Eftersom varje växtart kräver optimerade och specifika kemiska analysmetoder måste den bästa lösningsmedelsfraktionen och analysmetoden väljas från tidigare rapporter eller definieras genom experimentell design. Det är viktigt att förbereda formuleringar med det mest aktiva råextraktet och fraktionerna och testa dem på komplexa modeller för att förhindra utveckling av biofilmer och hålrum.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

General Pharmacological Principles

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion av<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Ägg extrakt för att identifiera mikrotubuli-associerade RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

En kvantitativ analys för att studera protein: DNA-interaktioner, Discover transkriptionsregulatorer av genuttryck, och identifiera nya antitumörmedel

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound masspektrometri - Ett kraftfullt verktyg för att identifiera nya c-di-GMP effektorproteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Tysta<em&gt; BRCA2</em&gt; För att identifiera nya BRCA2 reglerade biologiska funktioner i odlade humana celler

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Förfarande för att utvärdera effektiviteten av flockningsmedel för att avlägsna dispergerade partiklarna från växtextrakt

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Produktion och visualisering av bakteriell Spheroplasts och Protoplasts för att karakterisera antimikrobiell peptid lokalisering

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Framåt genetisk skärm med transgenkalcerande kalcium reporter Aequorin att identifiera nya mål i kalcium signalering

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolering av högkvalitativa murina förmaks- och ventrikulära myocyter för samtidiga mätningar av Ca2+ transienter och kalciumström av L-typ

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Profilering av H3K4me3 Modifiering i växter som använder klyvning under mål och tagning

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Omvänd genetisk metod för att identifiera regulatorer av pigmentering med zebrafisk

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...