Name: t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing at JoVE.com

Denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle review board på Sheba Medical Center, og informeret skriftligt samtykke blev indhentet fra alle deltagende emner.
1. DNA-isolering og kvantificering
<ol><li>Fordøjelse og celle lysis af tarmbiopsier<ol>
<li>Tarmbiopsier, enten friskopsamlet eller dem, der opbevares ved -20 °C eller -80 °C. Hvis du bruger frosne biopsier, optø på is.</li>
		<li>Der tilsættes 600 μL nuclei lysisopløsning til et sterilt mikrocentrifugerør på 1...

<ol>
	<li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V(D)J+recombination.">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, 45-55 (2002).</li><li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+Recombination:+Mechanism,+Errors,+and+Fidelity.">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire:+pitfalls+and+opportunities.">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li><li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools:+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses.">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+repertoire+analysis+in+polygenic+autoimmune+diseases.">Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases.</a> Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency.">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD.">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia.">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).</li><li>Chapman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T-cell+Receptor+Repertoire+in+Inflamed+Tissues+of+Patients+with+Crohn's+Disease+Through+Deep+Sequencing.">Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+receptor+beta+repertoire+patterns+in+pediatric+ulcerative+colitis.">Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases.">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+patients.">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li><li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases.">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li><li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn's+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence.">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/HighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling.">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333 (2013).</li><li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies:+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency.">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).</li><li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency:+a+review.">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li><li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy.">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis.">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li><li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders:+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing.">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li><li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+towards+personalized+immunology.">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).</li><li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors.">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).</li><li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma.">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li><li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy.">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li><li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia.">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li><li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing:+Techniques+and+Future+Challenges.">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).</li><li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR.">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing.">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li></ol>

Ændringer i overflod og funktion af B og T lymfocytter er ofte forekommende i forskellige maligniteter18, kroniske inflammatoriske lidelser (f.eks ulcerativ colitis og leddegigt)10,19, og i forskellige immundefekt17,20. Den nuværende metode bruger NGS til at lette et dybtgående billede af TCR- og BCR-repertoirer, hvilket gør det muligt at opdage subtile ændringer i T- og B-cel...

Det adaptive immunsystem, der består af T- og B-lymfocytter, bruger immunologisk hukommelse til at genkende et tidligere stødt antigen og indlede en hurtig reaktion. Lymfocytter genereres i knoglemarven og modnes i thymus (T-celler) eller knoglemarv (B-celler). Både T-cellereceptoren (TCR) og B-cellereceptoren (BCR) viser unikke konfigurationer, der tillader genkendelse af specifikke antigener. I homeostase cirkulerer T- og B-celler konstant og undersøger billionerne af forskellige peptider præsenteret på antigen-præsenterende celler. TCR eller BCR ligation af et specifikt antigen med høj affinitet, sammen med passende co-stimulation, fører til celleaktivering, hvilket resulterer i cytokin sekretion, klonisk ekspansion og generering af antistoffer, i tilfælde af B-celler.
Det enorme udvalg af de forskellige T- eller B-celler kaldes kollektivt immunrepertoire, hvilket muliggør anerkendelse af utallige forskellige epitoper. For at generere et så stort repertoire finder en kompleks proces med tilfældig samling af forskellige gensegmenter sted, hvilket skaber næsten uendelige kombinationer af receptorer, der kan binde unikke antigener1. Denne proces, kaldet V(D)J rekombination, omfatter omlægninger af forskellige variable (V), mangfoldighed (D) og sammenføjning (J) gener, ledsaget af tilfældige sletninger og indsættelser af nukleotider i vejkryds2.
Arkitekturen i det adaptive immunsystem har interesseret forskere på forskellige områder i mange årtier. Tidligere blev Sanger sekventering, komplementær bestemmelse region 3 (CDR3) spektring og flowcytometri brugt til at karakterisere immunrepertoiret, men gav lav opløsning. I det sidste årti har fremskridt inden for næste generations sekventeringsmetoder (NGS) muliggjort dybdegående indsigt i karakteristika og sammensætning af en persons TCR- og BCR-repertoirer3,4. Disse HTS-sekvens (High-ThroughPut Systems) sekvens og behandler millioner af omarrangerede TCR- eller BCR-produkter samtidigt og muliggør en analyse med høj opløsning af specifikke T- og B-celler på nukleotid- eller aminosyreniveau. NGS giver en ny strategi for at studere immunrepertoiret i både sundhed og sygdom. Undersøgelser, der anvendte HTS, påviste ændrede TCR- og BCR-repertoirer i autoimmune sygdomme5, primære immundefekt6,7og maligniteter, såsom i akut myeloid leukæmi8. Ved hjælp af NGS har vi og andre vist oligoklonal ekspansion af specifikke T- og B-cellekloner hos patienter med inflammatorisk tarmsygdom (IBD), herunder colitis ulcerosa og Crohns sygdom9,10,11,12,13,14. Samlet set tyder undersøgelser fra forskellige områder på, at ændringer i repertoiret spiller en afgørende rolle i patogenese af immunmedierede lidelser.
Den nuværende protokol beskriver en metode til isolering af DNA fra tarmbiopsier og blod, generering af TCRβ- og IGH PCR-biblioteker til NGS og udførelse af sekventeringskørsel. Vi leverer også grundlæggende trin i immunrepertoire dataanalyse. Denne protokol kan også anvendes til generering af TCRα-, TCRγ- og IGL-biblioteker. Metoden er også kompatibel med andre organer (f.eks. lymfeknuder, tumorer, synovialvæske, fedtvæv osv.), så længe der anvendes vævsspecifikke fordøjelsesprotokoller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>8187631104051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08543.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N8080241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Bioer</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td>For Tapestation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>For Tapestation. Tubes sold seperately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphotrack Assay kit</td>
			<td>Invivoscribe</td>
			<td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td>
			<td>Each includes 24 indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>Includes standard flow cell type and all reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra pure water</td>
			<td>Bio-lab</td>
			<td>7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard DNA isolation kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing

Immunologisk hukommelse, kendetegnende for adaptiv immunitet, er orkestreret af T og B lymfocytter. I omløb og forskellige organer er der milliarder af unikke T- og B-cellekloner, og hver enkelt kan binde et specifikt antigen, hvilket fører til spredning, differentiering og / eller cytokin sekretion. Den enorme heterogenitet i T- og B-celler genereres ved tilfældig rekombination af forskellige genetiske segmenter. Næste generations sekventeringsteknologier (NGS), der er udviklet i det sidste årti, muliggør et hidtil uset dybtgående billede af T- og B-cellereceptorens immunrepertoire. Undersøgelser i forskellige inflammatoriske tilstande, immundefekt, infektioner og maligniteter viste markante ændringer i kloning, genbrug og biofysiske egenskaber ved immunrepertoire, hvilket giver vigtig indsigt i den rolle, adaptive immunrespons i forskellige lidelser.
Her giver vi en detaljeret protokol for NGS af immunrepertoire af T- og B-celler fra blod og væv. Vi præsenterer en pipeline, der starter fra DNA-isolation gennem biblioteksforberedelse, sekventering på NGS sequencer og slutter med grundlæggende analyser. Denne metode muliggør udforskning af specifikke T- og B-celler på nukleotid- eller aminosyreniveau og kan således identificere dynamiske ændringer i lymfocytpopulationer og mangfoldighedsparametre i forskellige sygdomme. Denne teknik går langsomt ind i klinisk praksis og har potentiale til identifikation af nye biomarkører, risiko stratificering og præcisionsmedicin.

Heri beskriver vi en metode til DNA-isolering fra tarmvæv og blod, forberedelse af biblioteker til NGS og grundlæggende trin i en sekventeringskørsel til immunrepertoiresekvensering. Kørslen genererer fastq-filer, som yderligere kan konverteres til fasta-filer til brug i den internationale ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST-platform. Denne HTS udfører og administrerer mange analyser af titusinder af omarrangerede TCRβ- og IGH-sekvenser på nukleotidniveau15. IMGT/HighV-QUEST muliggør analyse...

Watch this Scientific Journal Video about T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing at JoVE.com

T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

Den nuværende protokol beskriver en metode til DNA-isolering fra blodprøver og tarmbiopsier, generering af TCRβ- og IGH PCR-biblioteker til næste generations sekventering, udførelse af en NGS-kørsel og grundlæggende dataanalyse.

T- og B-cellereceptor immunrepertoireanalyse ved hjælp af næste generations sekventering

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

Denne metode muliggør udforskning af specifikke T- og B-celler på nukleotid- eller aminosyreniveau og kan således identificere dynamiske ændringer i lymfocytpopulationer og mangfoldighedsparametre i forskellige lidelser. Fordelen ved næste generations sekventering er evnen til at identificere unikke T- eller B-cellekloner og spore dem på forskellige anatomiske steder eller i forskellige individer. Dette har potentiale til at identificere nye biomarkører i forskellige sygdomme.Naomi Salamon, en forskningsassistent fra mit laboratorium, vil demonstrere denne procedure. Begynd med at udføre fordøjelse og celle lysis af tarmbiopsier. Hent tarmbiopsier, enten friskindsamlet eller opbevaret ved negativ 20 eller negativ 80 grader Celsius.Hvis du bruger frosne biopsier, optø dem på is. Der tilsættes 600 mikroliter nuclei lysisopløsning til et sterilt mikrocentrifugerør på 1,7 milliliter, kølet på is. Placer derefter en biopsi i røret, og inkuber det ved 65 grader Celsius i 15 til 30 minutter.Tilsæt 17,5 mikroliter på 20-milligram-per-milliliter proteinase K, og inkuber røret natten over ved 55 grader Celsius, med blid rysten. Efter inkubationen skal prøven afkøles til stuetemperatur i fem minutter. For DNA-isolering fra blod, forsigtigt rock røret, indtil det er grundigt blandet.Derefter overføres blod til et sterilt 15-milliliter centrifugerør, der indeholder ni milliliter celle lysisopløsning. Vend røret flere gange i løbet af en 10-minutters inkubationsperiode ved stuetemperatur. Centrifuge ved 600g i 10 minutter ved stuetemperatur.Kassér derefter så meget supernatant som muligt uden at forstyrre den synlige hvide pellet. Vortex røret kraftigt i 15 sekunder, indtil helt genbruges. Tilsæt tre milliliter nuclei lysis opløsning, og pipette flere gange, hvilket får opløsningen til at blive tyktflydende.Der tilsættes proteinudfældningsbuffer til prøven. Derefter vortex kraftigt i 20 sekunder, og inkubere det på is i fem minutter. Centrifuge ved 16.000 g i fire minutter for at danne en stram pellet, der indeholder de udfældede proteiner.Overfør forsigtigt supernatant uden at forstyrre pellet til et nyt 1,7-milliliter rør. Tilsæt en milliliter 2-propanol til røret, der indeholder supernatanten, og bland det forsigtigt ved invertering. DNA'et skal blive synligt som et hvidt flydende stof.Centrifuge ved 16.000 gange g i et minut, og fjern supernatanten helt. Tilsæt en milliliter frisklavet 70% ethanol, og vend røret flere gange. Centrifuge det ved 16.000 g i et minut ved stuetemperatur.Kassér derefter forsigtigt supernatanten. Gentag ethanolvasken. Lad derefter DNA-pellet til lufttørre i 10 til 15 minutter.Tilføj 50 mikroliter ultra-rent vand til DNA'et, og udfør DNA-kvantificering som beskrevet i tekstmanuskriptet. Brug 150 nanogram DNA til at forberede biblioteket til sekventering. Placer pipetter og spidser i emhætten med UV-lys i 15 minutter for at nedbryde rest-DNA.I mellemtiden, tillade de forskellige indeks rør og DNA polymerase at tø på is. I en biologisk hætte tilsættes 45 mikroliter fra de forskellige indeksrør til PCR-rørene, idet du sørger for at undgå krydskontaminering. Derefter tilsættes 0,2 mikroliter af DNA-polymerase og fem mikroliter af det forberedte DNA i PCR-rørene.Kør PCR ved hjælp af et forudindstillet program i overensstemmelse med producentens anvisninger. Brug magnetiske perler til fjernelse af overskydende primere, nukleotider og enzymer. Varm perlerne til stuetemperatur i mindst 30 minutter, og forbered nok frisk 80% ethanol til 400 mikroliter pr prøve.Tilsæt perlerne til hvert PCR-rør, og bland ved pipetter 10 gange. Inkuber rørene i 10 minutter ved stuetemperatur. Den blandede prøve anbringes på magnetstativet i fem minutter.Derefter indsug den klare væske, og kassér. Indsug den resterende væske ved hjælp af en 10-mikroliter spids. Tilsæt 200 mikroliter på 80% ethanol til hver prøve, og inkuber i 30 sekunder.Aspirat 195 mikroliter ethanol, og kassér. Derefter suges den resterende væske ved hjælp af en 10-mikroliter spids. Gentag ethanolvasken.Åbn derefter rørenes hætter, og lad dem lufttørre i fem minutter. Efter fem minutter fjernes prøverne fra det magnetiske stativ, og der tilsættes 25 mikroliter elueringsbuffer. Bland ved pipettering indtil homogen, og inkuber ved stuetemperatur i to minutter.Placer rørene på magnetstativet i fem minutter. Overfør derefter 22 mikroliter til et nyt PCR-rør, og mål DNA-koncentrationen. Kvantificere ampliconen som beskrevet i tekstmanuskriptet.Efter beregning af den endelige DNA-koncentration og størrelsen i basispar af produktets top, skal du forberede en ny fortyndingsblanding til hver prøve og overføre to mikroliter af den til en ny poolblanding. Forbered en frisk opløsning af 0,2 normal natriumhydroxid, og tilsæt 10 mikroliter til det fortyndede bibliotek. Inkuber i fem minutter ved stuetemperatur for at denaturere det dobbeltstrengede DNA.Derefter tilsættes 980 mikroliter af forkølet buffer fra sættet til røret, der indeholder DNA, og vortex kort. Læg 600 mikroliter af det endelige bibliotek på den udpegede patron, og læg prøverne i maskinen. Hvis du vil udføre sekventeringsanalyser, skal du hente sekventeringsmålinger fra sequenceren og kontrollere, at dataene er inden for de relevante intervaller.Gentag kørslen for prøver, der ikke opfylder kriterierne. Denne protokol blev brugt til at udføre en grundlæggende analyse af repræsentative autologe blod- og rektalprøver af en patient med IL10-receptormangel og en historie med svær infantil-debut IBD. Prøver blev analyseret for både TCR-beta og IGH repertoire.Alle kloner kan identificeres ved deres unikke sekvens på nukleotid- eller aminosyreniveau. Disse sekvenser kan sammenlignes mellem forskellige patienter i søgen efter delte kloner eller hos den samme patient mellem forskellige anatomiske steder. De fem hyppigste kloner for hver prøve er vist her.TreeMap billeder blev genereret for et bredt overblik over repertoiret. Hver farvet firkant repræsenterer en anden klon, og størrelsen korrelerer med dens frekvens. Disse TreeMap billeder viser klonisk ekspansion i tarm IGH repertoire.I modsætning hertil observeres der i TCR-beta-repertoiret markant klonisk ekspansion i blodet sammenlignet med den autologe tarm. På genniveau giver NGS oplysninger om V-, D- og J-brug på niveau med enten gen, familie eller allel. Desuden kan specifikke VDJ kombinationer udledes af data for TCR-beta og IGH repertoirer, afslører differentieret gen brug mønstre under forskellige forhold.Denne protokol kan anvendes på både DNA og RNA og kan bruges til at generere TCR-alpha, TCR-gamma og IGL repertoirer. Det er også kompatibelt med andre organer efter små fordøjelsesændringer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

The Lymphatic and Immune System

SCIENTISTS IN ACTION

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering af precursor B-celle-undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effektiv Isolation Protokol for B og T lymfocytter fra Human Palatine tonsiller

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Brug røntgenkrystallografi, Biofysik, og funktionelle assays til Bestem Mekanismer Governing T-celle receptor Anerkendelse af kræft antigener

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualisere aktin og mikrotubulus Cytoskeletons på B-celle immun Synapse ved hjælp af stimuleret Emission udtynding (STED) mikroskopi

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse af Shear Flow-induceret Migration af Murine Marginal Zone B-celler In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identifikation af mus og humant antistof repertoirer af næste generations sekventering

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Undersøgelse af organelle dynamik i B-celler under dannelse af immun synapse

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Gene Knock-in af CRISPR / Cas9 og Celle sortering i makrofag og T Cellelinjer

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...