Name: t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing at JoVE.com

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele beoordelingscommissie van het Sheba Medical Center en er werd geïnformeerde schriftelijke toestemming verkregen van alle deelnemende proefpersonen.
1. DNA-isolatie en kwantificering
<ol><li>Spijsvertering en celanalyse van darmbiopten<ol>
<li>Haal darmbiopten op, vers verzameld of opgeslagen bij -20 °C of -80 °C. Als u bevroren biopten gebruikt, ontdooi dan op ijs.</li>
		<li>Voeg 600 μL kernanalyseoplossing toe aan een steriele microc...

<ol>
	<li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V(D)J+recombination.">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, 45-55 (2002).</li><li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+Recombination:+Mechanism,+Errors,+and+Fidelity.">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire:+pitfalls+and+opportunities.">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li><li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools:+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses.">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+repertoire+analysis+in+polygenic+autoimmune+diseases.">Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases.</a> Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency.">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD.">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia.">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).</li><li>Chapman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T-cell+Receptor+Repertoire+in+Inflamed+Tissues+of+Patients+with+Crohn's+Disease+Through+Deep+Sequencing.">Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+receptor+beta+repertoire+patterns+in+pediatric+ulcerative+colitis.">Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases.">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+patients.">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li><li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases.">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li><li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn's+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence.">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/HighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling.">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333 (2013).</li><li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies:+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency.">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).</li><li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency:+a+review.">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li><li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy.">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis.">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li><li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders:+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing.">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li><li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+towards+personalized+immunology.">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).</li><li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors.">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).</li><li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma.">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li><li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy.">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li><li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia.">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li><li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing:+Techniques+and+Future+Challenges.">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).</li><li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR.">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing.">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li></ol>

Veranderingen in overvloed en functie van B- en T-lymfocyten worden vaak aangetroffen in verschillende maligniteiten18, chronische ontstekingsstoornissen (bijv. colitis ulcerosa en reumatoïde artritis)10,19, en in verschillende immunodeficiënties17,20. De huidige methode maakt gebruik van NGS om een diepgaand beeld van TCR- en BCR-repertoires te vergemakkelijken, waardoor subtiel...

Het adaptieve immuunsysteem, bestaande uit T- en B-lymfocyten, maakt gebruik van immunologisch geheugen om een eerder aangetroffen antigeen te herkennen en een snelle reactie te initiëren. Lymfocyten worden gegenereerd in het beenmerg en rijpen in de thymus (T-cellen) of het beenmerg (B-cellen). Zowel de T-celreceptor (TCR) als de B-celreceptor (BCR) vertonen unieke configuraties die herkenning van specifieke antigenen mogelijk maken. In homeostase circuleren en onderzoeken T- en B-cellen voortdurend de triljoenen verschillende peptiden die worden gepresenteerd op antigeen-presenterende cellen. TCR- of BCR-ligatie van een specifiek antigeen met een hoge affiniteit, samen met de juiste co-stimulatie, leidt tot celactivatie, wat resulteert in cytokinesecretie, klonale expansie en generatie van antilichamen, in het geval van B-cellen.
De enorme reeks van de verschillende T- of B-cellen wordt gezamenlijk immuunrepertoire genoemd, waardoor talloze verschillende epitopen kunnen worden herkennen. Om zo'n uitgebreid repertoire te genereren, vindt een complex proces van willekeurige assemblage van verschillende gensegmenten plaats, waardoor bijna eindeloze combinaties van receptoren ontstaan die unieke antigenen kunnen binden1. Dit proces, V(D)J recombinatie genoemd, omvat herschikkingen van verschillende variabele (V), diversiteit (D) en het samenvoegen van (J) genen, vergezeld van willekeurige deleties en invoegingen van nucleotiden in de knooppunten2.
De architectuur van het adaptieve immuunsysteem interesseert wetenschappers al tientallen jaren op verschillende gebieden. In het verleden werden Sanger-sequencing, complementaire bepalende regio 3 (CDR3) spectratypering en flowcytometrie gebruikt om het immuunrepertoire te karakteriseren, maar zorgden voor een lage resolutie. In het afgelopen decennium maakten de vooruitgang in next-generation sequencing (NGS) methoden diepgaand inzicht in de kenmerken en samenstelling van iemands TCR- en BCR-repertoires3,4. Deze HTS-sequentie (High Throughput Systems) sequentie en verwerken miljoenen herschikte TCR- of BCR-producten tegelijkertijd en maken een hoge-resolutieanalyse van specifieke T- en B-cellen op nucleotide- of aminozuurniveau mogelijk. NGS biedt een nieuwe strategie om het immuunrepertoire in zowel gezondheid als ziekte te bestuderen. Studies met HTS toonden veranderde TCR- en BCR-repertoires aan bij auto-immuunziekten5, primaire immunodeficiënties6,7en maligniteiten, zoals bij acute myeloïde leukemie8. Met behulp van NGS hebben wij en anderen oligoklonale expansie van specifieke T- en B-celklonen aangetoond, bij patiënten met inflammatoire darmziekte (IBD), waaronder colitis ulcerosa en de ziekte van Crohn9,10,11,12,13,14. Over het algemeen suggereren studies uit verschillende gebieden dat veranderingen in het repertoire een cruciale rol spelen bij de pathogenese van immuungemedieerde aandoeningen.
Het huidige protocol beschrijft een methode voor isolatie van DNA uit intestinale biopten en bloed, het genereren van TCRβ- en IGH PCR-bibliotheken voor NGS en de prestaties van sequencing run. We bieden ook basisstappen in de analyse van immuunrepertoiregegevens. Dit protocol kan ook worden toegepast voor het genereren van TCRα-, TCRγ- en IGL-bibliotheken. De methode is ook compatibel met andere organen (bijv. lymfeklieren, tumoren, synoviale vloeistof, vetweefsel, enz.) zolang weefselspecifieke spijsverteringsprotocollen worden gebruikt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>8187631104051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08543.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N8080241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Bioer</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td>For Tapestation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>For Tapestation. Tubes sold seperately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphotrack Assay kit</td>
			<td>Invivoscribe</td>
			<td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td>
			<td>Each includes 24 indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>Includes standard flow cell type and all reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra pure water</td>
			<td>Bio-lab</td>
			<td>7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard DNA isolation kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing

Immunologisch geheugen, het kenmerk van adaptieve immuniteit, wordt georkestreerd door T- en B-lymfocyten. In omloop en verschillende organen zijn er miljarden unieke T- en B-cel klonen, en elk kan een specifiek antigeen binden, wat leidt tot proliferatie, differentiatie en / of cytokinesecretie. De enorme heterogeniteit in T- en B-cellen wordt gegenereerd door willekeurige recombinatie van verschillende genetische segmenten. Next-generation sequencing (NGS) technologieën, ontwikkeld in het afgelopen decennium, maken een ongekend diepgaand beeld van het T- en B-celreceptor-immuunrepertoire mogelijk. Studies bij verschillende ontstekingsaandoeningen, immunodeficiënties, infecties en maligniteiten toonden duidelijke veranderingen aan in clonaliteit, gengebruik en biofysische eigenschappen van immuunrepertoire, wat belangrijke inzichten gaf over de rol van adaptieve immuunresponsen bij verschillende aandoeningen.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor NGS van immuunrepertoire van T- en B-cellen uit bloed en weefsel. We presenteren een pijplijn die begint met DNA-isolatie door bibliotheekvoorbereiding, sequencing op NGS-sequencer en eindigt met basisanalyses. Deze methode maakt het mogelijk om specifieke T- en B-cellen op nucleotide- of aminozuurniveau te verkennen en kan zo dynamische veranderingen in lymfocytenpopulaties en diversiteitsparameters bij verschillende ziekten identificeren. Deze techniek komt langzaam in de klinische praktijk en heeft het potentieel voor identificatie van nieuwe biomarkers, risicostratificatie en precisiegeneeskunde.

Hierin beschrijven we een methode voor DNA-isolatie uit darmweefsel en bloed, voorbereiding van bibliotheken voor NGS en basisstappen van een sequencingrun voor immuunrepertoiresequenties. De run genereert fastq-bestanden, die verder kunnen worden geconverteerd naar fasta-bestanden voor gebruik in het internationale ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST-platform. Deze HTS voert en beheert vele analyses van tienduizenden herschikte TCRβ- en IGH-sequenties, op nucleotideniveau15. IMGT/HighV-QUEST maakt...

Watch this Scientific Journal Video about T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing at JoVE.com

T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

Het huidige protocol beschrijft een methode voor DNA-isolatie van bloedmonsters en darmbiopten, generatie van TCRβ- en IGH PCR-bibliotheken voor de volgende generatie sequencing, prestaties van een NGS-run en basisgegevensanalyse.

T- en B-celreceptor immuunrepertoireanalyse met behulp van next-generation sequencing

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

Deze methode maakt het mogelijk om specifieke T- en B-cellen op nucleotide- of aminozuurniveau te verkennen en kan zo dynamische veranderingen in lymfocytenpopulaties en diversiteitsparameters bij verschillende aandoeningen identificeren. Het voordeel van next-generation sequencing is de mogelijkheid om unieke T- of B-celklonen te identificeren en te volgen op verschillende anatomische locaties of in verschillende individuen. Dit heeft het potentieel voor identificatie van nieuwe biomarkers bij verschillende ziekten.Die procedure zal Naomi Salamon zijn, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium. Begin met het uitvoeren van spijsvertering en cellysis van intestinale biopten. Haal darmbiopten op die vers zijn verzameld of opgeslagen bij negatief 20 of negatief 80 graden Celsius.Als u bevroren biopten gebruikt, ontdooi ze dan op ijs. Voeg 600 microliter kernenoplossing toe aan een steriele microcentrifugebuis van 1,7 milliliter, gekoeld op ijs. Plaats vervolgens een biopsie in de buis en incubeer deze gedurende 15 tot 30 minuten op 65 graden Celsius.Voeg 17,5 microliter 20 milligram per milliliter proteinase K toe en incubeer de tube 's nachts op 55 graden Celsius, met zachtjes schudden. Laat het monster na de incubatie vijf minuten afkoelen tot kamertemperatuur. Voor DNA-isolatie uit bloed, schommel de buis voorzichtig totdat deze grondig is gemengd.Breng vervolgens bloed over naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter met negen milliliter cellysisoplossing. Keer de buis meerdere keren om tijdens een incubatieperiode van 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer op 600g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Gooi vervolgens zoveel mogelijk supernatant weg zonder de zichtbare witte pellet te verstoren. Draai de buis gedurende 15 seconden krachtig om volledig geresuspendeerd. Voeg drie milliliter kernanalyseoplossing toe en pipetteer meerdere keren, waardoor de oplossing stroperig wordt.Voeg eiwitprecipitatiebuffer toe aan het monster. Draai vervolgens krachtig gedurende 20 seconden en incubeer het gedurende vijf minuten op ijs. Centrifugeer gedurende vier minuten op 16.000 g om een strakke pellet te vormen die de neergeslagen eiwitten bevat.Breng supernatant voorzichtig over zonder de pellet te verstoren in een nieuwe buis van 1,7 milliliter. Voeg een milliliter 2-propanol toe aan de buis met het supernatant en meng het voorzichtig door om te keren. Het DNA moet zichtbaar worden als een witte zwevende substantie.Centrifugeer gedurende één minuut op 16.000 keer g en verwijder het supernatant volledig. Voeg een milliliter vers bereide 70% ethanol toe en keer de buis meerdere keren om. Centrifugeer het op 16,000g gedurende een minuut op kamertemperatuur.Gooi vervolgens het supernatant voorzichtig weg. Herhaal de ethanolwas. Laat de DNA-pellet vervolgens 10 tot 15 minuten aan de lucht drogen.Voeg 50 microliters ultrazuiver water toe aan het DNA en voer DNA-kwantificering uit zoals beschreven in het teksthandschrift. Gebruik 150 nanogram DNA om de bibliotheek voor te bereiden op sequencing. Plaats pipetten en tips 15 minuten in de kap met UV-licht om rest-DNA af te breken.Laat ondertussen de verschillende indexbuizen en DNA-polymerase ontdooien op ijs. Voeg in een biologische kap 45 microliters van de verschillende indexbuizen toe aan de PCR-buizen, waarbij kruisbesmetting wordt voorkomen. Voeg vervolgens 0,2 microliter van het DNA-polymerase en vijf microliters van het voorbereide DNA toe aan de PCR-buizen.Voer PCR uit met behulp van een vooraf ingesteld programma volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik magnetische kralen voor het verwijderen van overtollige primers, nucleotiden en enzymen. Verwarm de kralen minstens 30 minuten op kamertemperatuur en bereid voldoende verse 80% ethanol voor 400 microliter per monster.Voeg de kralen toe aan elke PCR-buis en meng door 10 keer te pipetten. Incubeer de buizen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats het gemengde monster gedurende vijf minuten op de magnetische standaard.Aspireer dan de heldere vloeistof en gooi weg. Aspireer de resterende vloeistof met behulp van een tip van 10 microliter. Voeg 200 microliters van 80% ethanol toe aan elk monster en incubeer gedurende 30 seconden.Aspireer 195 microliter ethanol en gooi weg. Aspireer vervolgens de resterende vloeistof met behulp van een 10-microliter tip. Herhaal de ethanolwas.Open vervolgens de doppen van de buizen en laat ze vijf minuten aan de lucht drogen. Verwijder na vijf minuten de monsters van de magnetische standaard en voeg 25 microliters elutiebuffer toe. Meng door pipetten tot homogeen en incubeer op kamertemperatuur gedurende twee minuten.Plaats de buizen vijf minuten op de magnetische standaard. Breng vervolgens 22 microliters over naar een nieuwe PCR-buis en meet de DNA-concentratie. Kwantificeer het amplicon zoals beschreven in het teksthandschrift.Na het berekenen van de uiteindelijke DNA-concentratie en de grootte in basisparen van de piek van het product, bereidt u voor elk monster een nieuwe verdunningsmix voor en zet u er twee microliters van over naar een nieuwe poolmix. Bereid een verse oplossing van 0,2 normaal natriumhydroxide en voeg 10 microliters toe aan de verdunde bibliotheek. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om het dubbelstrengs DNA te denatureren.Voeg vervolgens 980 microliters voorgekoelde buffer uit de kit toe aan de buis met DNA en vortex kort. Plaats 600 microliters van de uiteindelijke bibliotheek op de daarvoor bestemde cartridge en plaats de monsters in de machine. Als u sequencinganalyse wilt uitvoeren, downloadt u sequencingstatistieken van de sequencer en controleert u of de gegevens zich binnen de juiste bereiken bevinden.Herhaal de uitvoering voor monsters die niet aan de criteria voldoen. Dit protocol werd gebruikt om een basisanalyse uit te voeren van representatieve autologe bloed- en rectale monsters van een patiënt met IL10-receptordeficiëntie en een voorgeschiedenis van ernstige infantiele IBD. Samples werden onderzocht voor zowel TCR-beta als IGH repertoire.Alle klonen kunnen worden geïdentificeerd door hun unieke volgorde op het nucleotide- of aminozuurniveau. Deze sequenties kunnen worden vergeleken tussen verschillende patiënten op zoek naar gedeelde klonen of bij dezelfde patiënt tussen verschillende anatomische sites. De vijf meest voorkomende klonen voor elk monster worden hier weergegeven.TreeMap afbeeldingen werden gegenereerd voor een breed overzicht van het repertoire. Elk gekleurd vierkant vertegenwoordigt een andere kloon en de grootte correleert met de frequentie. Deze TreeMap-afbeeldingen tonen klonale expansie in het intestinale IGH-repertoire.In het TCR-bètarepertoire daarentegen wordt een duidelijke klonale expansie waargenomen in het bloed in vergelijking met de autologe darm. Op genniveau geeft NGS informatie over het gebruik van V, D en J op het niveau van het gen, de familie of het allel. Bovendien kunnen specifieke VDJ-combinaties worden afgeleid uit de gegevens voor TCR-beta- en IGH-repertoires, waardoor differentiële gengebruikspatronen in verschillende omstandigheden worden onthuld.Dit protocol kan worden toegepast op zowel DNA als RNA en kan worden gebruikt om TCR-alpha, TCR-gamma en IGL repertoires te genereren. Het is ook compatibel met andere organen na lichte spijsverteringsmodificaties.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

The Lymphatic and Immune System

SCIENTISTS IN ACTION

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Efficiënte isolatie protocol voor B- en T-lymfocyten van Human Palatine Amandelen

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Small RNA Transfectie in primaire humane Th17 cellen door Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse van Shear Flow-geïnduceerde migratie van RattenUitrustingen Marginal Zone B cellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identificatie van muis en menselijk antilichaam Repertoires door Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...