Name: t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00
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Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel du Centre médical sheba, et le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les sujets participants.
1. Isolement et quantification de l’ADN
<ol><li>Digestion et lyse cellulaire des biopsies intestinales<ol>
<li>Récupérer les biopsies intestinales, soit fraîchement collectées, soit celles conservées à -20 °C ou -80 °C. Si vous utilisez des biopsies congelées, décongelez sur la glace.</li>
		<li>Ajo...

<ol>
	<li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V(D)J+recombination.">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, 45-55 (2002).</li><li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+Recombination:+Mechanism,+Errors,+and+Fidelity.">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire:+pitfalls+and+opportunities.">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li><li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools:+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses.">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency.">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD.">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia.">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).</li><li>Chapman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T-cell+Receptor+Repertoire+in+Inflamed+Tissues+of+Patients+with+Crohn's+Disease+Through+Deep+Sequencing.">Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+receptor+beta+repertoire+patterns+in+pediatric+ulcerative+colitis.">Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases.">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+patients.">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li><li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases.">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li><li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn's+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence.">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/HighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling.">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333 (2013).</li><li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies:+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency.">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).</li><li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency:+a+review.">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li><li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy.">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis.">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li><li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders:+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing.">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li><li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+towards+personalized+immunology.">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).</li><li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors.">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).</li><li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma.">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li><li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy.">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li><li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia.">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li><li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing:+Techniques+and+Future+Challenges.">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).</li><li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR.">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing.">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li></ol>

Des changements dans l’abondance et la fonction des lymphocytes B et T sont souvent rencontrés dans différentes malignités18, troubles inflammatoires chroniques (par exemple, colite ulcéreuse et polyarthrite rhumatoïde)10,19, et dans diverses immunodéficiences17,20. La méthode actuelle utilise NGS pour faciliter une vue approfondie des répertoires de TCR et de BCR, permet...

Le système immunitaire adaptatif, composé des lymphocytes de T et de B, utilise la mémoire immunologique pour identifier un antigène précédemment produit et lancer une réponse rapide. Les lymphocytes sont générés dans la moelle osseuse et mûrissent dans le thymus (lymphocytes T) ou la moelle osseuse (lymphocytes B). Le récepteur des lymphocytes T (TCR) et le récepteur des lymphocytes B (BCR) présentent des configurations uniques qui permettent la reconnaissance d’antigènes spécifiques. En homéostasie, les cellules T et B circulent constamment et enquêtent sur les billions de peptides différents présentés sur les cellules présentatrices d’antigènes. La ligature TCR ou BCR d’un antigène spécifique avec une forte affinité, ainsi qu’une costimulation appropriée, conduit à l’activation cellulaire, entraînant la sécrétion de cytokines, l’expansion clonale et la génération d’anticorps, dans le cas des cellules B.
L’énorme éventail des différents lymphocytes T ou B est collectivement appelé répertoire immunitaire, permettant la reconnaissance d’innombrables épitopes différents. Afin de générer un répertoire aussi vaste, un processus complexe d’assemblage aléatoire de différents segments de gènes a lieu, créant des combinaisons presque infinies de récepteurs qui peuvent lier des antigènes uniques1. Ce processus, appelé recombinaison V(D)J, comprend des réarrangements de différentes variables (V), diversités (D) et gènes de jonction (J), accompagnés de délétions aléatoires et d’insertions de nucléotides dans les jonctions2.
L’architecture du système immunitaire adaptatif intéresse les scientifiques dans différents domaines depuis de nombreuses décennies. Dans le passé, l’ordonnancement de Sanger, le spectratyping déterminant complémentaire de la région 3 (CDR3), et la cytométrie d’écoulement ont été utilisés pour caractériser le répertoire immunisé, mais ont fourni la basse résolution. Au cours de la dernière décennie, les progrès réalisés dans les méthodes de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont permis de mieux comprendre les caractéristiques et la composition des répertoires TCR et BCR d’un individu3,4. Ces systèmes à haut débit (HTS) séquencent et traitent des millions de produits TCR ou BCR réarrangés simultanément et permettent une analyse à haute résolution de cellules T et B spécifiques au niveau des nucléotides ou des acides aminés. Ngs fournit une nouvelle stratégie pour étudier le répertoire immunitaire dans la santé et la maladie. Les études utilisant HTS ont démontré des répertoires altérés de TCR et de BCR dans les maladies autoimmunes5,les immunodéficits primaires6,7,et les malignités, telles que dans la leucémie myéloïde aiguë8. En utilisant NGS, nous et d’autres avons montré l’expansion oligoclonale de clones spécifiques de cellules T et B, dans les patients présentant la maladie intestinale inflammatoire (MII), y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn9,10,11,12,13,14. De façon générale, les études de différents domaines suggèrent que les changements du répertoire aient un rôle crucial dans la pathogenèse des troubles à médiation immunitaire.
Le protocole actuel décrit une méthode d’isolement de l’ADN à partir de biopsies intestinales et de sang, la génération de bibliothèques de PCR TCRβ et IGH pour ngs, et la performance de l’exécution de séquençage. Nous fournissons également des étapes de base dans l’analyse des données du répertoire immunitaire. Ce protocole peut également être appliqué pour la génération de bibliothèques TCRα, TCRγ et IGL. La méthode est également compatible avec d’autres organes (p. ex. ganglions lymphatiques, tumeurs, liquide synovial, tissu adipeux, etc.) tant que des protocoles de digestion spécifiques aux tissus sont utilisés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>8187631104051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08543.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N8080241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Bioer</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td>For Tapestation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>For Tapestation. Tubes sold seperately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphotrack Assay kit</td>
			<td>Invivoscribe</td>
			<td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td>
			<td>Each includes 24 indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>Includes standard flow cell type and all reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra pure water</td>
			<td>Bio-lab</td>
			<td>7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard DNA isolation kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing

La mémoire immunologique, caractéristique de l’immunité adaptative, est orchestrée par les lymphocytes T et B. Dans la circulation et les différents organes, il y a des milliards de clones uniques de cellules T et B, et chacun d’eux peut lier un antigène spécifique, menant à la prolifération, à la différenciation et/ou à la sécrétion de cytokine. La grande hétérogénéité des lymphocytes T et B est générée par la recombinaison aléatoire de différents segments génétiques. Les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS), développées au cours de la dernière décennie, permettent une vue approfondie sans précédent du répertoire immunitaire des récepteurs des cellules T et B. Les études dans de diverses conditions inflammatoires, immunodéficits, infections et malignités ont démontré des changements marqués dans la clonalité, l’utilisation de gène, et les propriétés biophysiques du répertoire immunitaire, fournissant des informations importantes au sujet du rôle des immuno-réponses adaptatives dans différents désordres.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour ngs du répertoire immunitaire des cellules T et B du sang et des tissus. Nous présentons un pipeline partant de l’isolement de l’ADN à travers la préparation de la bibliothèque, le séquençage sur séquenceur NGS et se terminant par des analyses de base. Cette méthode permet l’exploration de cellules T et B spécifiques au niveau des nucléotides ou des acides aminés, et peut ainsi identifier des changements dynamiques dans les populations de lymphocytes et les paramètres de diversité dans différentes maladies. Cette technique entre lentement dans la pratique clinique et a le potentiel d’identifier de nouveaux biomarqueurs, la stratification des risques et la médecine de précision.

Ci-dessus, nous décrivons une méthode pour l’isolement d’ADN du tissu intestinal et du sang, la préparation des bibliothèques pour NGS, et les étapes de base d’une exécution de séquençage pour le séquençage du répertoire immunitaire. La course générera des fichiers fastq, qui peuvent être convertis en fichiers fasta pour une utilisation dans la plate-forme internationale ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST. Ce HTS réalise et gère de nombreuses analyses de dizaines de milliers de séquences TCRβ et ...

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T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

Le protocole actuel décrit une méthode d’isolement de l’ADN à partir d’échantillons de sang et de biopsies intestinales, la génération de bibliothèques de PCR TCRβ et IGH pour le séquençage de nouvelle génération, la performance d’une exécution NGS et l’analyse de données de base.

Analyse du répertoire immunitaire des récepteurs des lymphocytes T et B à l’aide du séquençage de nouvelle génération

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

Cette méthode permet l’exploration de cellules T et B spécifiques au niveau des nucléotides ou des acides aminés et peut ainsi identifier des changements dynamiques dans les populations de lymphocytes et les paramètres de diversité dans différents troubles. L’avantage du séquençage de nouvelle génération est la capacité d’identifier des clones de cellules T ou B uniques et de les suivre dans différents sites anatomiques ou chez différents individus. Cela a le potentiel d’identifier de nouveaux biomarqueurs dans diverses maladies.Naomi Salamon, une assistante de recherche de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Commencez par effectuer la digestion et la lyse cellulaire des biopsies intestinales. Récupérer des biopsies intestinales fraîchement collectées ou stockées à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius.Si vous utilisez des biopsies congelées, décongelez-les sur de la glace. Ajouter 600 microlitres de solution de nucléilyse à un tube de microcentrifuge stérile de 1,7 millilitre, réfrigéré sur de la glace. Ensuite, placez une biopsie dans le tube et incuber à 65 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes.Ajouter 17,5 microlitres de 20 milligrammes de protéinase K de 20 millilitres et incuber le tube pendant la nuit à 55 degrés Celsius, en secouant doucement. Après l’incubation, laissez l’échantillon refroidir à température ambiante pendant cinq minutes. Pour l’isolement de l’ADN du sang, basculez doucement le tube jusqu’à ce qu’il soit soigneusement mélangé.Ensuite, transférez le sang dans un tube de centrifugation stérile de 15 millilitres contenant neuf millilitres de solution de lyse cellulaire. Inverser le tube plusieurs fois au cours d’une période d’incubation de 10 minutes à température ambiante. Centrifuger à 600g pendant 10 minutes à température ambiante.Ensuite, jetez autant de surnageant que possible sans perturber la pastille blanche visible. Vortex le tube vigoureusement pendant 15 secondes jusqu’à ce qu’il soit complètement ressuscité. Ajouter trois millilitres de solution de lyse des noyaux et pipeter plusieurs fois, ce qui rend la solution visqueuse.Ajouter un tampon de précipitation de protéines à l’échantillon. Puis vortex vigoureusement pendant 20 secondes, et incuber sur la glace pendant cinq minutes. Centrifuger à 16 000 g pendant quatre minutes pour former une pastille serrée contenant les protéines précipitées.Transférer soigneusement le surnageant sans perturber la pastille dans un nouveau tube de 1,7 millilitre. Ajouter un millilitre de 2-propanol au tube contenant le surnageant et le mélanger doucement en l’inversant. L’ADN doit devenir visible sous la forme d’une substance flottante blanche.Centrifuger à 16 000 fois g pendant une minute et retirer complètement le surnageant. Ajouter un millilitre d’éthanol à 70% fraîchement préparé et inverser le tube plusieurs fois. Centrifuger à 16 000 g pendant une minute à température ambiante.Ensuite, jetez soigneusement le surnageant. Répétez le lavage à l’éthanol. Laissez ensuite la pastille d’ADN sécher à l’air pendant 10 à 15 minutes.Ajouter 50 microlitres d’eau ultra-pure à l’ADN et effectuer la quantification de l’ADN comme décrit dans le manuscrit textuel. Utilisez 150 nanogrammes d’ADN pour préparer la bibliothèque au séquençage. Placez les pipettes et les pointes dans le capot avec la lumière UV pendant 15 minutes pour décomposer l’ADN résiduel.Pendant ce temps, laissez les différents tubes index et l’ADN polymérase dégeler sur la glace. Dans une hotte biologique, ajoutez 45 microlitres des différents tubes index aux tubes PCR, en prenant soin d’éviter la contamination croisée. Ajoutez ensuite 0,2 microlitres de l’ADN polymérase et cinq microlitres de l’ADN préparé dans les tubes pcr.Exécutez la PCR à l’aide d’un programme prédéfini conformément aux instructions du fabricant. Utilisez des billes magnétiques pour éliminer les amorces, les nucléotides et les enzymes en excès. Réchauffer les billes à température ambiante pendant au moins 30 minutes et préparer suffisamment d’éthanol frais à 80% pour 400 microlitres par échantillon.Ajouter les perles à chaque tube PCR, et mélanger par pipetage 10 fois. Incuber les tubes pendant 10 minutes à température ambiante. Placez l’échantillon mélangé sur le support magnétique pendant cinq minutes.Ensuite, aspirez le liquide clair et jetez-le. Aspirer le liquide restant à l’aide d’une pointe de 10 microlitres. Ajouter 200 microlitres d’éthanol à 80 % à chaque échantillon et incuber pendant 30 secondes.Aspirer 195 microlitres d’éthanol et jeter. Aspirez ensuite le liquide restant à l’aide d’une pointe de 10 microlitres. Répétez le lavage à l’éthanol.Ouvrez ensuite les bouchons des tubes et laissez-les sécher à l’air pendant cinq minutes. Après cinq minutes, retirez les échantillons du support magnétique et ajoutez 25 microlitres de tampon d’élution. Mélanger par pipetage jusqu’à ce qu’il soit homogène, et incuber à température ambiante pendant deux minutes.Placez les tubes sur le support magnétique pendant cinq minutes. Ensuite, transférez 22 microlitres dans un nouveau tube PCR et mesurez la concentration d’ADN. Quantifier l’amplicon tel que décrit dans le manuscrit de texte.Après avoir calculé la concentration finale d’ADN et la taille en paires de bases du pic du produit, préparez un nouveau mélange de dilution pour chaque échantillon et transférez deux microlitres de celui-ci dans un nouveau mélange en piscine. Préparez une solution fraîche d’hydroxyde de sodium normal 0,2 et ajoutez 10 microlitres à la bibliothèque diluée. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante pour dénaturer l’ADN double brin.Ajoutez ensuite 980 microlitres de tampon pré-refroidi du kit au tube contenant de l’ADN, et vortex brièvement. Chargez 600 microlitres de la bibliothèque finale sur la cartouche désignée et placez les échantillons dans la machine. Pour effectuer une analyse de séquençage, téléchargez les métriques de séquençage à partir du séquenceur et vérifiez que les données se trouvent dans les plages appropriées.Répétez l’exécution pour les échantillons qui ne répondent pas aux critères. Ce protocole a été employé pour exécuter une analyse de base du sang autologous représentatif et des échantillons rectaux d’un patient présentant l’insuffisance de récepteur IL10 et une histoire d’infantile-début grave IBD. Des échantillons ont été analysés pour le répertoire TCR-bêta et IGH.Tous les clones peuvent être identifiés par leur séquence unique au niveau des nucléotides ou des acides aminés. Ces séquences peuvent être comparées entre différents patients à la recherche de clones partagés ou chez le même patient entre différents sites anatomiques. Les cinq clones les plus fréquents pour chaque échantillon sont présentés ici.Des images TreeMap ont été générées pour une vue d’ensemble du répertoire. Chaque carré coloré représente un clone différent, et la taille est en corrélation avec sa fréquence. Ces images TreeMap démontrent l’expansion clonale dans le répertoire intestinal d’IGH.En revanche, dans le répertoire TCR-bêta, une expansion clonale marquée est observée dans le sang par rapport à l’intestin autologue. Au niveau du gène, NGS fournit des informations concernant l’utilisation de V, D, et J au niveau du gène, de la famille, ou de l’allèle. D’ailleurs, des combinaisons spécifiques de VDJ peuvent être déduites des données pour des répertoires de TCR-bêta et d’IGH, révélant des modèles différentiels d’utilisation de gène dans diverses conditions.Ce protocole peut être appliqué sur l’ADN et l’ARN et peut être utilisé pour générer des répertoires TCR-alpha, TCR-gamma et IGL. Il est également compatible avec d’autres organes après de légères modifications de digestion.

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Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Souris Transnuclear avec des spécificités T pré-définis Cell Receptor contre Toxoplasma gondii Obtenues par TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

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Immunologie et infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

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Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Protocole d&#39;isolation efficace pour B et les lymphocytes T à partir des amygdales palatines humaines

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Utilisation de cristallographie aux rayons X, biophysique, et des tests fonctionnels pour déterminer les mécanismes d&#39;administration des lymphocytes T Reconnaissance des récepteurs du cancer Antigènes

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

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Analyse de cisaillement induite par le flux de Migration des cellules B Zone marginale murin In Vitro

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Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

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Étudier la dynamique d'Organelle dans les cellules B pendant la formation immunitaire de synapse

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

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