Name: t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00
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Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des Sheba Medical Center genehmigt und die schriftliche Zustimmung aller teilnehmenden Probanden wurde eingeholt.
1. DNA-Isolierung und Quantifizierung
<ol><li>Verdauung und Zelllyse von Darmbiopsien<ol>
<li>Rufen Sie Darmbiopsien ab, die entweder frisch gesammelt oder bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden. Wenn Sie gefrorene Biopsien verwenden, tauen Sie auf Eis auf.</li>
		<li>600 μL Kernlyselösung in ein steriles 1,7 ml Mikr...

<ol>
	<li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V(D)J+recombination.">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, 45-55 (2002).</li><li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+Recombination:+Mechanism,+Errors,+and+Fidelity.">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire:+pitfalls+and+opportunities.">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li><li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools:+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses.">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+repertoire+analysis+in+polygenic+autoimmune+diseases.">Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases.</a> Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency.">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD.">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia.">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).</li><li>Chapman, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases.">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+patients.">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li><li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases.">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li><li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn's+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence.">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/HighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling.">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333 (2013).</li><li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies:+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency.">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).</li><li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency:+a+review.">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li><li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy.">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis.">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li><li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders:+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing.">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li><li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+towards+personalized+immunology.">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).</li><li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors.">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).</li><li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma.">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li><li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy.">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li><li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia.">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li><li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing:+Techniques+and+Future+Challenges.">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).</li><li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR.">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing.">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li></ol>

Veränderungen in Der Häufigkeit und Funktion von B- und T-Lymphozyten treten häufig bei verschiedenen Malignomenauf 18, chronisch entzündlichen Erkrankungen (z. B. Colitis ulcerosa und rheumatoide Arthritis)10,19und in verschiedenen Immundefekten17,20. Die aktuelle Methode nutzt NGS, um einen detaillierten Überblick über TCR- und BCR-Repertoires zu ermöglichen, was den Nachw...

Das adaptive Immunsystem, bestehend aus T- und B-Lymphozyten, nutzt das immunologische Gedächtnis, um ein zuvor angetroffenes Antigen zu erkennen und eine schnelle Reaktion einzuleiten. Lymphozyten werden im Knochenmark erzeugt und reifen im Thymus (T-Zellen) oder Knochenmark (B-Zellen). Sowohl der T-Zell-Rezeptor (TCR) als auch der B-Zell-Rezeptor (BCR) weisen einzigartige Konfigurationen auf, die die Erkennung spezifischer Antigene ermöglichen. In der Homöostase zirkulieren T- und B-Zellen ständig und untersuchen die Billionen verschiedener Peptide, die auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden. Die TCR- oder BCR-Ligatur eines spezifischen Antigens mit hoher Affinität führt zusammen mit einer geeigneten Co-Stimulation zur Zellaktivierung, was im Falle von B-Zellen zu Zytokinsekretion, klonaler Expansion und Generierung von Antikörpern führt.
Die enorme Vielfalt der verschiedenen T- oder B-Zellen wird zusammenfassend als Immunrepertoire bezeichnet und ermöglicht das Erkennen unzähliger verschiedener Epitope. Um ein so großes Repertoire zu generieren, findet ein komplexer Prozess der zufälligen Anordnung verschiedener Gensegmente statt, wodurch nahezu endlose Kombinationen von Rezeptoren entstehen, die einzigartige Antigene binden können1. Dieser Prozess, der als V(D)J-Rekombination bezeichnet wird, umfasst Umlagerungen verschiedener variabler (V), Diversität (D) und verbindende (J) Gene, begleitet von zufälligen Deletionen und Insertionen von Nukleotiden in den Verbindungen2.
Die Architektur des adaptiven Immunsystems interessiert Wissenschaftler in verschiedenen Bereichen seit vielen Jahrzehnten. In der Vergangenheit wurden Sanger-Sequenzierung, komplementär bestimmende Region 3 (CDR3) Spektrentypisierung und Durchflusszytometrie verwendet, um das Immunrepertoire zu charakterisieren, lieferten jedoch eine niedrige Auflösung. In den letzten zehn Jahren ermöglichten Fortschritte bei Next-Generation-Sequencing-Methoden (NGS) einen tiefen Einblick in die Eigenschaften und die Zusammensetzung der TCR- und BCR-Repertoires eines Individuums3,4. Diese Hochdurchsatzsysteme (HTS) sequenzieren und verarbeiten Millionen von neu angeordneten TCR- oder BCR-Produkten gleichzeitig und ermöglichen eine hochauflösende Analyse spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene. NGS bietet eine neue Strategie, um das Immunrepertoire sowohl in den Bereichen Gesundheit als auch Krankheit zu untersuchen. Studien mit HTS zeigten veränderte TCR- und BCR-Repertoires bei Autoimmunerkrankungen5, primären Immundefekten6,7und Malignomen, wie z. B. bei akuter myeloischer Leukämie8. Mit NGS haben wir und andere eine oligoklonale Expansion spezifischer T- und B-Zellklone bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn,gezeigt 9,10,11,12,13,14. Insgesamt deuten Studien aus verschiedenen Bereichen darauf hin, dass Veränderungen im Repertoire eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese immunvermittelter Störungen spielen.
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von DNA aus Darmbiopsien und Blut, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für NGS und die Durchführung des Sequenzierungslaufs. Wir bieten auch grundlegende Schritte in der Immunrepertoire-Datenanalyse. Dieses Protokoll kann auch für die Generierung von TCRα-, TCRγ- und IGL-Bibliotheken angewendet werden. Die Methode ist auch mit anderen Organen (z.B. Lymphknoten, Tumoren, Synovialflüssigkeit, Fettgewebe etc.) kompatibel, sofern gewebespezifische Verdauungsprotokolle verwendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>8187631104051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08543.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N8080241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Bioer</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td>For Tapestation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>For Tapestation. Tubes sold seperately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphotrack Assay kit</td>
			<td>Invivoscribe</td>
			<td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td>
			<td>Each includes 24 indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>Includes standard flow cell type and all reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra pure water</td>
			<td>Bio-lab</td>
			<td>7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard DNA isolation kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing

Das immunologische Gedächtnis, das Kennzeichen der adaptiven Immunität, wird durch T- und B-Lymphozyten orchestriert. Im Kreislauf und in verschiedenen Organen gibt es Milliarden von einzigartigen T- und B-Zellklonen, und jeder kann ein spezifisches Antigen binden, was zu Proliferation, Differenzierung und / oder Zytokinsekretion führt. Die enorme Heterogenität in T- und B-Zellen wird durch zufällige Rekombination verschiedener genetischer Segmente erzeugt. Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS), die in den letzten zehn Jahren entwickelt wurden, ermöglichen einen beispiellosen detaillierten Einblick in das Immunrepertoire der T- und B-Zellrezeptoren. Studien zu verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, Immundefekten, Infektionen und Malignomen zeigten deutliche Veränderungen der Klonalität, der Gennutzung und der biophysikalischen Eigenschaften des Immunrepertoires und lieferten wichtige Erkenntnisse über die Rolle adaptiver Immunantworten bei verschiedenen Erkrankungen.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für NGS des Immunrepertoires von T- und B-Zellen aus Blut und Gewebe zur Verfügung. Wir präsentieren eine Pipeline, die von der DNA-Isolierung über die Bibliotheksvorbereitung, die Sequenzierung auf NGS-Sequenzierern bis hin zu grundlegenden Analysen beginnt. Diese Methode ermöglicht die Erforschung spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene und kann so dynamische Veränderungen in Lymphozytenpopulationen und Diversitätsparametern bei verschiedenen Erkrankungen identifizieren. Diese Technik kommt langsam in die klinische Praxis und hat das Potenzial für die Identifizierung neuartiger Biomarker, Risikostratifizierung und Präzisionsmedizin.

Hier beschreiben wir eine Methode zur DNA-Isolierung aus Darmgewebe und Blut, die Vorbereitung von Bibliotheken für NGS und grundlegende Schritte eines Sequenzierungslaufs zur Immunrepertoire-Sequenzierung. Der Lauf generiert fastq-Dateien, die weiter in fasta-Dateien für die Verwendung in der internationalen ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST-Plattform konvertiert werden können. Dieses HTS führt viele Analysen von Zehntausenden von neu angeordneten TCRβ- und IGH-Sequenzen auf der Nukleotidebene15...

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T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur DNA-Isolierung aus Blutproben und Darmbiopsien, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation, die Durchführung eines NGS-Laufs und die grundlegende Datenanalyse.

T- und B-Zell-Rezeptor-Immunrepertoireanalyse mittels Next-Generation-Sequencing

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

Diese Methode ermöglicht die Erforschung spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene und kann so dynamische Veränderungen in Lymphozytenpopulationen und Diversitätsparametern bei verschiedenen Erkrankungen identifizieren. Der Vorteil der Next-Generation-Sequenzierung ist die Fähigkeit, einzigartige T- oder B-Zellklone zu identifizieren und sie an verschiedenen anatomischen Stellen oder bei verschiedenen Individuen zu verfolgen. Dies hat das Potenzial, neuartige Biomarker bei verschiedenen Krankheiten zu identifizieren.Dieses Verfahren wird Naomi Salamon, eine Forschungsassistentin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Verdauung und Zelllyse von Darmbiopsien. Rufen Sie Darmbiopsien entweder frisch gesammelt oder bei negativen 20 oder negativen 80 Grad Celsius gelagert.Wenn Sie gefrorene Biopsien verwenden, tauen Sie sie auf Eis auf. 600 Mikroliter Kernlyselösung in ein steriles 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben, das auf Eis gekühlt wird. Dann legen Sie eine Biopsie in die Röhre und inkubieren Sie sie bei 65 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten.Fügen Sie 17,5 Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei 55 Grad Celsius unter sanftem Schütteln. Lassen Sie die Probe nach der Inkubation fünf Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen. Zur DNA-Isolierung aus dem Blut die Röhre vorsichtig schaukeln, bis sie gründlich gemischt ist.Anschließend wird das Blut in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit neun Millilitern Zelllyselösung überführen. Kehren Sie das Röhrchen während einer 10-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur mehrmals um. Zentrifuge bei 600g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Entsorgen Sie dann so viel Überstand wie möglich, ohne das sichtbare weiße Pellet zu stören. Wirbeln Sie das Rohr 15 Sekunden lang kräftig vor, bis es vollständig resuspendiert ist. Fügen Sie drei Milliliter Kernlyselösung hinzu und pipetetten Sie mehrmals, wodurch die Lösung viskos wird.Fügen Sie der Probe einen Proteinfällungspuffer hinzu. Dann 20 Sekunden lang kräftig wirbeln und fünf Minuten lang auf Eis inkubieren. Zentrifuge bei 16.000 g für vier Minuten, um ein dichtes Pellet zu bilden, das die gefällten Proteine enthält.Den Überstand vorsichtig ohne Störung des Pellets in ein neues 1,7-Milliliter-Rohr überführen. Fügen Sie einen Milliliter 2-Propanol in das Röhrchen mit dem Überstand hinzu und mischen Sie es vorsichtig durch Invertieren. Die DNA soll als weiße schwimmende Substanz sichtbar werden.Zentrifuge bei 16.000 mal g für eine Minute und entfernen Sie den Überstand vollständig. Fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes 70% Ethanol hinzu und kehren Sie das Röhrchen mehrmals um. Zentrifugieren Sie es bei 16.000g für eine Minute bei Raumtemperatur.Dann verwerfen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche. Dann lassen Sie das DNA-Pellet für 10 bis 15 Minuten an der Luft trocknen.Fügen Sie der DNA 50 Mikroliter hochreines Wasser hinzu und führen Sie eine DNA-Quantifizierung durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie 150 Nanogramm DNA, um die Bibliothek für die Sequenzierung vorzubereiten. Legen Sie Pipetten und Spitzen mit UV-Licht für 15 Minuten in die Haube, um Rest-DNA abzubauen.Lassen Sie in der Zwischenzeit die verschiedenen Indexröhrchen und dna-Polymerase auf Eis auftauen. In einer biologischen Haube 45 Mikroliter aus den verschiedenen Indexröhrchen zu den PCR-Röhrchen geben, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Anschließend werden 0,2 Mikroliter der DNA-Polymerase und fünf Mikroliter der vorbereiteten DNA in die PCR-Röhrchen eingeschmischt.Führen Sie die PCR mit einem voreingestellten Programm gemäß den Anweisungen des Herstellers aus. Verwenden Sie magnetische Perlen zur Entfernung von überschüssigen Primern, Nukleotiden und Enzymen. Erwärmen Sie die Perlen mindestens 30 Minuten lang auf Raumtemperatur und bereiten Sie genügend frisches 80% Ethanol für 400 Mikroliter pro Probe zu.Fügen Sie die Perlen zu jedem PCR-Röhrchen hinzu und mischen Sie es 10 Mal durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Röhrchen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Legen Sie die gemischte Probe für fünf Minuten auf den Magnetständer.Dann saugen Sie die klare Flüssigkeit an und entsorgen Sie sie. Saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit mit einer 10-Mikroliter-Spitze an. Fügen Sie 200 Mikroliter 80% Ethanol zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie für 30 Sekunden.195 Mikroliter Ethanol absaugen und entsorgen. Dann saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit mit einer 10-Mikroliter-Spitze an. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche.Öffnen Sie dann die Kappen der Schläuche und lassen Sie sie fünf Minuten an der Luft trocknen. Nach fünf Minuten die Proben aus dem Magnetständer entfernen und 25 Mikroliter Elutionspuffer hinzufügen. Durch Pipettieren bis zum Homogenen mischen und bei Raumtemperatur zwei Minuten lang inkubieren.Legen Sie die Röhren für fünf Minuten auf den Magnetständer. Dann 22 Mikroliter in eine neue PCR-Röhre übertragen und die DNA-Konzentration messen. Quantifizieren Sie das Amplicon wie im Textmanuskript beschrieben.Nachdem Sie die endgültige DNA-Konzentration und die Größe des Peaks des Produkts in Basenpaaren berechnet haben, bereiten Sie für jede Probe eine neue Verdünnungsmischung vor und übertragen Sie zwei Mikroliter davon in eine neue Poolmischung. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,2 normalem Natriumhydroxid vor und fügen Sie 10 Mikroliter zur verdünnten Bibliothek hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren.Dann fügen Sie 980 Mikroliter vorgekühlten Puffer aus dem Kit in die Röhre mit DNA und Wirbel kurz hinzu. Legen Sie 600 Mikroliter der endgültigen Bibliothek auf die dafür vorgesehene Patrone und legen Sie die Proben in die Maschine. Um eine Sequenzanalyse durchzuführen, laden Sie Sequenzierungsmetriken vom Sequenzer herunter, und überprüfen Sie, ob sich die Daten innerhalb der entsprechenden Bereiche befinden.Wiederholen Sie den Lauf für Beispiele, die die Kriterien nicht erfüllen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine grundlegende Analyse von repräsentativen autologen Blut- und Rektalproben eines Patienten mit IL10-Rezeptormangel und einer Vorgeschichte von schwerer infantiler IBD durchzuführen. Die Proben wurden sowohl für das TCR-beta- als auch für das IGH-Repertoire untersucht.Alle Klone können durch ihre einzigartige Sequenz auf Nukleotid- oder Aminosäureebene identifiziert werden. Diese Sequenzen können zwischen verschiedenen Patienten auf der Suche nach gemeinsamen Klonen oder im selben Patienten zwischen verschiedenen anatomischen Stellen verglichen werden. Die fünf häufigsten Klone für jedes Beispiel sind hier dargestellt.Für einen breiten Überblick über das Repertoire wurden TreeMap-Bilder generiert. Jedes farbige Quadrat stellt einen anderen Klon dar, und die Größe korreliert mit seiner Häufigkeit. Diese TreeMap-Bilder zeigen die klonale Expansion im intestinalen IGH-Repertoire.Im Gegensatz dazu wird im TCR-beta-Repertoire eine ausgeprägte klonale Expansion im Blut im Vergleich zum autologen Darm beobachtet. Auf Genebene liefert NGS Informationen über die Verwendung von V, D und J auf der Ebene von Gen, Familie oder Allel. Darüber hinaus können aus den Daten für TCR-beta- und IGH-Repertoires spezifische VDJ-Kombinationen abgeleitet werden, die differentielle Gennutzungsmuster unter verschiedenen Bedingungen aufdecken.Dieses Protokoll kann sowohl auf DNA als auch auf RNA angewendet werden und kann verwendet werden, um TCR-alpha-, TCR-gamma- und IGL-Repertoires zu generieren. Es ist auch mit anderen Organen nach leichten Verdauungsmodifikationen kompatibel.

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JoVE Journal

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Immunology and Infection

Unit 1

The Lymphatic and Immune System

SCIENTISTS IN ACTION

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Mit Röntgenkristallographie, Biophysik, und funktionelle Assays zur Bestimmung der Mechanismen, die T-Zell-Rezeptor-Erkennung von Krebs-Antigene

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identifizierung von Maus und humanen Antikörpers Repertoires durch Sequenzierung der nächsten Generation

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...