Name: t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing at JoVE.com

この研究は、シェバ医療センターの機関審査委員会によって承認され、すべての参加対象からインフォームド・コンセントが得られました。
1. DNAの分離と定量
<ol><li>腸内生検の消化と細胞のリシス<ol>
<li>腸内生検を取り出し、採取したばかりか、-20°Cまたは-80°Cで保存したものを回収する。 凍結生検を使用する場合は、氷の上で解凍します。</li>
		<li>氷の上で冷やさ?...

<ol>
	<li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V(D)J+recombination.">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, 45-55 (2002).</li><li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+Recombination:+Mechanism,+Errors,+and+Fidelity.">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire:+pitfalls+and+opportunities.">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li><li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools:+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses.">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+repertoire+analysis+in+polygenic+autoimmune+diseases.">Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases.</a> Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency.">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD.">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia.">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).</li><li>Chapman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T-cell+Receptor+Repertoire+in+Inflamed+Tissues+of+Patients+with+Crohn's+Disease+Through+Deep+Sequencing.">Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+receptor+beta+repertoire+patterns+in+pediatric+ulcerative+colitis.">Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases.">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+patients.">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li><li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases.">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li><li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn's+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence.">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/HighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling.">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333 (2013).</li><li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies:+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency.">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).</li><li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency:+a+review.">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li><li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy.">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis.">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li><li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders:+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing.">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li><li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+towards+personalized+immunology.">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).</li><li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors.">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).</li><li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma.">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li><li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy.">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li><li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia.">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li><li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing:+Techniques+and+Future+Challenges.">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).</li><li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR.">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing.">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li></ol>

Bリンパ球およびTリンパ球の存在量および機能の変化は、しばしば異なる悪性腫瘍18において遭遇するが、慢性炎症性疾患(例えば、潰瘍性大腸炎および関節リウマチ)10、19、および種々の免疫不全17、20において。現在の方法では、NGSを利用してTCRおよびBCRレパートリーの詳細なビューを?...

Tリンパ球とBリンパ球で構成される適応免疫系は、免疫学的記憶を利用して、以前に遭遇した抗原を認識し、迅速な応答を開始する。リンパ球は骨髄で発生し、胸腺(T細胞)または骨髄(B細胞)で成熟する。T細胞受容体(TCR)とB細胞受容体(BCR)の両方が、特異的抗原の認識を可能にする独自の構成を示す。ホメオスタシスでは、T細胞とB細胞は常に循環し、抗原提示細胞に提示される異なるペプチドの兆を調査する。高い親和性を有する特定の抗原のTCRまたはBCRライゲーションは、適切な共刺激と共に、細胞活性化をもたらし、サイトカイン分泌、クローン拡張および抗体の生成をもたらし、B細胞の場合に。
異なるTまたはB細胞の巨大な配列は、総称して免疫レパートリーと呼ばれます, 異なるエピトープの無数の認識を可能にします.このような広大なレパートリーを生成するために、異なる遺伝子セグメントのランダム集合の複雑なプロセスが起こり、ユニークな抗原1に結合することができる受容体のほぼ無限の組み合わせを作成する。このプロセスは、V(D)Jの組み換えと呼ばれ、異なる変数(V)、多様性(D)および結合(J)遺伝子の再配列を含み、結合部2におけるヌクレオチドのランダムな欠失および挿入を伴う。
適応免疫システムのアーキテクチャは、何十年もの間、異なる分野の科学者に興味を持っています。以前は、サンガーシーケンシング、相補決定領域3(CDR3)スペクトルタイピング、およびフローサイトメトリーを使用して免疫レパートリーを特徴付け、低分解能を提供した。過去10年間で、次世代シーケンシング(NGS)法の進歩により、個人のTCRおよびBCRレパートリー3,4の特性と組成に関する詳細な洞察が可能になった。これらのハイスループットシステム(HTS)配列と処理は、同時に並べ替えられたTCRまたはBCR製品の数百万を、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで特定のTおよびB細胞の高解像度分析を可能にします。NGSは、健康と病気の両方の免疫レパートリーを研究するための新しい戦略を提供します。HTSを利用した研究は、自己免疫疾患におけるTCRおよびBCRレパートリーの改変を実証した5、原発性免疫不全6、7、および急性骨髄性白血病における悪性腫瘍8などである。NGSを用いて、我々および他の人々は、炎症性腸疾患(IBD)を有する患者において、潰瘍性大腸炎およびクローン病9、10、11、12、13、14のオリゴクローナル拡張を示している。全体として、異なる分野からの研究は、レパートリーの変化が免疫媒介性疾患の病因において重要な役割を果たしていることを示唆している。
現在のプロトコルは、腸内生検および血液からのDNAの分離、NGS用のTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、およびシーケンシング実行の性能を記述する。免疫レパートリーデータ解析の基本ステップも提供しています。このプロトコルは、TCRα、TCRγ、およびIGLライブラリの生成にも適用できます。この方法は、組織特異的な消化プロトコルが使用されている限り、他の器官(例えば、リンパ節、腫瘍、滑液、脂肪組織など)と互換性がある。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>8187631104051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08543.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N8080241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Bioer</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td>For Tapestation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>For Tapestation. Tubes sold seperately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphotrack Assay kit</td>
			<td>Invivoscribe</td>
			<td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td>
			<td>Each includes 24 indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>Includes standard flow cell type and all reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra pure water</td>
			<td>Bio-lab</td>
			<td>7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard DNA isolation kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing

免疫学的記憶は、適応免疫の特徴であり、Tリンパ球およびBリンパ球によって調整される。循環や異なる器官では、何十億ものユニークなT細胞クローンとB細胞クローンがあり、それぞれが特定の抗原に結合し、増殖、分化および/またはサイトカイン分泌につながる。T細胞とB細胞の広大な異種性は、異なる遺伝的セグメントのランダムな組み換えによって生成される。過去10年間に開発された次世代シーケンシング(NGS)技術は、TおよびB細胞受容体免疫レパートリーの前例のない詳細なビューを可能にします。様々な炎症性疾患、免疫不全、感染症および悪性腫瘍の研究は、クローン性、遺伝子使用法、および免疫レパートリーの生物物理学的特性の顕著な変化を示し、異なる疾患における適応免疫応答の役割に関する重要な洞察を提供した。
ここでは、血液および組織からのTおよびB細胞の免疫レパートリーのNGSに対する詳細なプロトコルを提供する。DNAの単離から図書館の準備、NGSシーケンサーのシーケンシング、基本的な分析で終わるパイプラインを提示します。この方法は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの特定のTおよびB細胞の探索を可能にし、したがって、異なる疾患におけるリンパ球集団および多様性パラメータの動的変化を同定することができる。この技術はゆっくりと臨床現場に入っており、新しいバイオマーカー、リスク階層化、精密医療の同定の可能性を秘めています。

ここでは、腸組織および血液からのDNA分離方法、NGS用ライブラリの調製、免疫レパートリーシーケンシングのためのシーケンシングランの基本的なステップについて述べうる。実行は、国際ImMunoGenetics(IMGT)/HighV-QUESTプラットフォームで使用するために、さらにfastaファイルに変換することができ、fastqファイルを生成します。このHTSは、ヌクレオチドレベル15で、何万もの再?...

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T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

現在のプロトコルは、血液サンプルおよび腸内生検からのDNA分離、次世代シーケンシングのためのTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、NGSランの性能および基本的なデータ分析のための方法を記述する。

次世代シーケンシングを用いたT細胞受容体免疫レパートリー解析

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

この方法は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで特定のTおよびB細胞を探索し、したがって、異なる障害におけるリンパ球集団および多様性パラメータの動的変化を同定することができる。次世代シーケンシングの利点は、ユニークなTまたはB細胞クローンを同定し、異なる解剖学的部位または異なる個体でそれらを追跡する能力です。これは、多様な疾患における新しいバイオマーカーの同定の可能性を秘めています。その手順を実証するのは、私の研究室の研究助手であるナオミ・サラモンです。まず、腸内生検の消化と細胞のリシスを行う。腸内生検を取り出す、新鮮な収集または負の20または負の80°Cで保存します。凍結生検を使用する場合は、氷の上でそれらを解凍します。氷の上で冷やした無菌1.7ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに600マイクロリットルの核溶解溶液を加えます。その後、生検をチューブに入れ、摂氏65度で15〜30分間インキュベートします。10ミリグラム/ミリリットルプロテイナーゼKの17.5マイクロリットルを加え、穏やかな揺れで摂氏55度で一晩チューブをインキュベートします。インキュベーション後、試料を室温まで5分間冷却します。血液からのDNA分離のために、チューブが完全に混合されるまでチューブを穏やかに揺らす。その後、9ミリリットルの細胞溶解溶液を含む無菌15ミリリットル遠心分離管に血液を移す。室温で10分間のインキュベーション期間中にチューブを数回反転させます。室温で10分間600gで遠心分離機。その後、可視の白いペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を捨てます。完全に再懸濁されるまで15秒間チューブを激しく渦盛り。3ミリリットルの核溶解溶液を加え、ピペットを数回加え、粘性になる。サンプルにタンパク質沈殿バッファーを加えます。その後、20秒間激しく渦を流し、氷の上で5分間インキュベートします。遠心分離機を16,000gで4分間、沈殿したタンパク質を含むタイトペレットを形成した。慎重に新しい1.7ミリリットルのチューブにペレットを邪魔することなく上清を移動します。上清を含むチューブに2-プロパノールの1ミリリットルを加え、反転させて軽く混ぜます。DNAは白い浮遊物質として見えるようになるはずです。16,000回gで遠心分離機を1分間、上清を完全に取り除いた。作りたての70%エタノールを1ミリリットル加え、チューブを数回反転させます。室温で1分16,000gで遠心分離します。その後、上清を慎重に捨てます。エタノール洗浄を繰り返します。その後、DNAペレットを10〜15分間空気乾燥させます。DNAに50マイクロリットルの超純水を加え、テキスト原稿に記載されているようにDNA定量を行う。150ナノグラムのDNAを使用して、シーケンシング用のライブラリを準備します。残存DNAを分解するために15分間UVライトでフードにピペットとチップを入れます。一方、異なるインデックスチューブとDNAポリメラーゼが氷の上で解凍することを可能にする。生物学的フードでは、異なるインデックスチューブから45マイクロリットルをPCRチューブに加えて、クロスコンタミネーションを避けるように注意してください。その後、0.2マイクロリットルのDNAポリメラーゼと調製したDNAの5マイクロリットルをPCRチューブに加えます。メーカーの指示に従って、プリセットプログラムを使用してPCRを実行します。過剰なプライマー、ヌクレオチド、酵素の除去には、磁気ビーズを使用してください。ビーズを室温まで少なくとも30分間温め、サンプルあたり400マイクロリットルに対して80%エタノールを十分に新鮮に調製します。各PCRチューブにビーズを加え、10回ピペットで混ぜます。室温で10分間チューブをインキュベートします。混合サンプルを磁気スタンドに5分間置きます。その後、透明な液体を吸引し、廃棄する。残りの液体を10マイクロリットルの先端を使用して吸引する。各サンプルに200マイクロリットルの80%エタノールを加え、30秒間インキュベートします。195マイクロリットルのエタノールを吸引し、廃棄する。その後、残りの液体を10マイクロリットルの先端を使用して吸引する。エタノール洗浄を繰り返します。その後、チューブのキャップを開け、5分間空気乾燥させます。5分後、磁気スタンドからサンプルを取り出し、溶出バッファーを25マイクロリットル加えます。均質になるまでピペットで混ぜ、室温で2分間インキュベートする。チューブを磁気スタンドに5分間置きます。次いで、22マイクロリットルを新しいPCRチューブに移し、DNA濃度を測定します。テキスト原稿に記載されているアンプリコンを定量化します。製品のピークの塩基対の最終的なDNA濃度とサイズを計算した後、各サンプルに新しい希釈ミックスを準備し、その2マイクロリットルを新しいプールミックスに移します。0.2通常の水酸化ナトリウムの新鮮な溶液を調製し、希釈されたライブラリに10マイクロリットルを加えます。二本鎖DNAを変性させるために室温で5分間インキュベートする。次に、キットから980マイクロリットルのプレチルドバッファーをDNAを含むチューブに加え、渦を短時間加えます。最終ライブラリの600マイクロリットルを指定されたカートリッジに積み込み、サンプルを機械に入れます。シーケンス分析を実行するには、シーケンシング・メトリックをシーケンサーからダウンロードし、データが適切な範囲内にあるかどうかを確認します。基準を満たしていないサンプルに対して実行を繰り返します。このプロトコルは、IL10受容体欠損症の患者の代表的な自家血および直腸サンプルの基礎分析および重度の乳児発症IBDの歴史を実行するために使用された。TCR-βおよびIGHレパートリーの両方についてサンプルをアッセイした。すべてのクローンは、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでのそれらのユニークな配列によって同定することができる。これらの配列は、共有クローンを探索する場合、または異なる解剖学的部位間の同じ患者で異なる患者間で比較することができる。各サンプルの最も頻繁な 5 つのクローンを次に示します。レパートリーの概要を示すツリーマップ画像が生成されました。色付きの正方形はそれぞれ異なるクローンを表し、サイズはその頻度と相関します。これらのTreeMap画像は、腸管IGHレパートリーのクローン拡張を示す。これに対し、TCR-βレパートリーでは、自家の腸に比べて血中に顕著なクローン拡張が認められる。遺伝子レベルでは、NGSは、遺伝子、家族、または対立遺伝子のレベルでV、D、およびJの使用に関する情報を提供します。さらに、TCR-βとIGHレパートリーのデータから特定のVDJの組み合わせを推測することができ、様々な条件での遺伝子の差動パターンを明らかにする。このプロトコルは、DNAとRNAの両方に適用することができ、TCR-α、TCR-γ、およびIGLレパートリーを生成するために使用することができます。また、わずかな消化修飾後に他の臓器と互換性があります。

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SCIENTISTS IN ACTION

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

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免疫・感染学

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

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Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

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Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

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Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

マウスと次世代シーケンサーによるひと抗体のレパートリーの同定

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

免疫シナプス形成中のB細胞におけるオルガネラダイナミクスの研究

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...