Name: t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing at JoVE.com

Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Sheba Medical Center, e o consentimento por escrito informado foi obtido de todos os sujeitos participantes.
1. Isolamento e quantificação do DNA
<ol><li>Digestão e lise celular de biópsias intestinais<ol>
<li>Recuperar biópsias intestinais, coletadas recentemente ou armazenadas a -20 °C ou -80 °C. Se usar biópsias congeladas, descongele no gelo.</li>
		<li>Adicione 600 μL de solução de lise nuclei a um tubo de m...

<ol>
	<li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V(D)J+recombination.">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, 45-55 (2002).</li><li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+Recombination:+Mechanism,+Errors,+and+Fidelity.">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire:+pitfalls+and+opportunities.">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li><li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools:+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses.">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+repertoire+analysis+in+polygenic+autoimmune+diseases.">Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases.</a> Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency.">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD.">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia.">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).</li><li>Chapman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T-cell+Receptor+Repertoire+in+Inflamed+Tissues+of+Patients+with+Crohn's+Disease+Through+Deep+Sequencing.">Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+receptor+beta+repertoire+patterns+in+pediatric+ulcerative+colitis.">Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases.">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+patients.">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li><li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases.">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li><li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn's+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence.">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/HighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling.">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333 (2013).</li><li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies:+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency.">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).</li><li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency:+a+review.">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li><li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy.">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis.">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li><li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders:+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing.">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li><li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+towards+personalized+immunology.">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).</li><li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors.">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).</li><li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma.">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li><li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy.">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li><li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia.">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li><li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing:+Techniques+and+Future+Challenges.">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).</li><li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR.">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing.">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li></ol>

Alterações na abundância e função de linfócitos B e T são frequentemente encontradas em diferentes malignidades18, distúrbios inflamatórios crônicos (por exemplo, colite ulcerativa e artrite reumatoide)10,19, e em várias imunodeficiências17,20. O método atual utiliza o NGS para facilitar uma visão aprofundada dos repertórios TCR e BCR, permitindo a detecção de alte...

O sistema imunológico adaptativo, composto por linfócitos T e B, utiliza memória imunológica para reconhecer um antígeno previamente encontrado e iniciar uma resposta rápida. Os linfócitos são gerados na medula óssea e maduros nas células timo (células T) ou medula óssea (células B). Tanto o receptor de células T (TCR) quanto o receptor de células B (BCR) exibem configurações únicas que permitem o reconhecimento de antígenos específicos. Na homeostase, as células T e B circulam constantemente e pesquisam os trilhões de peptídeos diferentes apresentados em células que apresentam antígenos. A ligadura TCR ou BCR de um antígeno específico com alta afinidade, juntamente com a co-estimulação adequada, leva à ativação celular, resultando em secreção de citocinas, expansão clonal e geração de anticorpos, no caso de células B.
A enorme matriz das diferentes células T ou B é coletivamente denominada repertório imunológico, permitindo o reconhecimento de incontáveis epítopos diferentes. A fim de gerar um repertório tão vasto, ocorre um complexo processo de montagem aleatória de diferentes segmentos genéticos, criando combinações quase infinitas de receptores que podem ligar antígenos únicos1. Esse processo, chamado de recombinação V(D)J, inclui rearranjos de diferentes genes variáveis (V), diversidade (D) e junção (J), acompanhados de supressões aleatórias e inserções de nucleotídeos nas junções2.
A arquitetura do sistema imunológico adaptativo tem interessado cientistas em diferentes campos por muitas décadas. No passado, o sequenciamento de Sanger, a especificação da região 3 (CDR3) complementar e a citometria de fluxo foram utilizados para caracterizar o repertório imunológico, mas proporcionavam baixa resolução. Na última década, os avanços nos métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) permitiram uma visão aprofundada das características e composição dos repertórios TCR e BCR de um indivíduo3,4. Esses sistemas de alta produtividade (HTS) sequenciam e processam milhões de produtos TCR ou BCR reorganizados simultaneamente e permitem uma análise de alta resolução de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido. A NGS fornece uma nova estratégia para estudar o repertório imunológico tanto na saúde quanto na doença. Estudos utilizando HTS demonstraram repertórios alterados de TCR e BCR em doenças autoimunes5, imunodeficiências primárias6,7e malignidades, como na leucemia mielóide aguda8. Utilizando NGS, nós e outros mostramos expansão oligoclonal de clones específicos de células T e B, em pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn9,10,11,12,13,14. No geral, estudos de diferentes campos sugerem que mudanças no repertório têm um papel crucial na patogênese de distúrbios imunomu mediados.
O protocolo atual descreve um método de isolamento do DNA de biópsias intestinais e sangue, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para NGS, e desempenho de sequenciamento executado. Também fornecemos passos básicos na análise de dados do repertório imunológico. Este protocolo também pode ser aplicado para a geração de bibliotecas TCRα, TCRγ e IGL. O método também é compatível com outros órgãos (por exemplo, linfonodos, tumores, fluido sinovial, tecido adiposo, etc.) desde que sejam utilizados protocolos de digestão específicos do tecido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>8187631104051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08543.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N8080241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Bioer</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td>For Tapestation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>For Tapestation. Tubes sold seperately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphotrack Assay kit</td>
			<td>Invivoscribe</td>
			<td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td>
			<td>Each includes 24 indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>Includes standard flow cell type and all reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra pure water</td>
			<td>Bio-lab</td>
			<td>7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard DNA isolation kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing

A memória imunológica, a marca registrada da imunidade adaptativa, é orquestrada por linfócitos T e B. Em circulação e diferentes órgãos, há bilhões de clones de células T e B únicos, e cada um pode ligar um antígeno específico, levando à proliferação, diferenciação e/ou secreção de citocinas. A grande heterogeneidade nas células T e B é gerada pela recombinação aleatória de diferentes segmentos genéticos. As tecnologias de sequenciamento de última geração (NGS), desenvolvidas na última década, permitem uma visão aprofundada sem precedentes do repertório imunológico do receptor de células T e B. Estudos em várias condições inflamatórias, imunodeficiências, infecções e malignidades demonstraram mudanças acentuadas na clonalidade, uso genético e propriedades biofísicas do repertório imunológico, fornecendo importantes insights sobre o papel das respostas imunes adaptativas em diferentes distúrbios.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para NGS de repertório imunológico de células T e B a partir de sangue e tecido. Apresentamos um pipeline a partir do isolamento do DNA através da preparação da biblioteca, sequenciamento no sequenciador NGS e terminando com análises básicas. Este método permite a exploração de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido, podendo assim identificar mudanças dinâmicas nas populações de linfócitos e parâmetros de diversidade em diferentes doenças. Esta técnica está entrando lentamente na prática clínica e tem potencial para identificação de novos biomarcadores, estratificação de risco e medicina de precisão.

Aqui, descrevemos um método para isolamento do DNA do tecido intestinal e sangue, preparação de bibliotecas para NGS, e etapas básicas de um sequenciamento para sequenciamento do repertório imunológico. A execução gerará arquivos fastq, que podem ser convertidos em arquivos fasta para uso na plataforma internacional IMGT)/HighV-QUEST. Este HTS realiza e gerencia muitas análises de dezenas de milhares de sequências TCRβ e IGH reorganizadas, no nível nucleotídeo15. O IMGT/HighV-QUEST p...

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T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

O protocolo atual descreve um método de isolamento de DNA a partir de amostras de sangue e biópsias intestinais, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para sequenciamento de próxima geração, desempenho de uma execução de NGS e análise de dados básicos.

Análise de repertório imune do receptor de células T e B usando sequenciamento de última geração

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

Este método permite a exploração de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido e, assim, pode identificar mudanças dinâmicas nas populações de linfócitos e parâmetros de diversidade em diferentes transtornos. A vantagem do sequenciamento de próxima geração é a capacidade de identificar clones de células T ou B únicos e rastreá-los em diferentes locais anatômicos ou em diferentes indivíduos. Isso tem potencial para identificação de novos biomarcadores em diversas doenças.Demonstrando que o procedimento será Naomi Salamon, uma assistente de pesquisa do meu laboratório. Comece realizando digestão e lise celular de biópsias intestinais. Recuperar biópsias intestinais recém-coletadas ou armazenadas a 20 negativos ou negativos 80 graus Celsius.Se usar biópsias congeladas, descongele-as no gelo. Adicione 600 microliters de solução de lise nuclei a um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro estéril, refrigerado no gelo. Em seguida, coloque uma biópsia no tubo, e incuba-a a 65 graus Celsius por 15 a 30 minutos.Adicione 17,5 microliters de 20 miligramas por mililitro proteinase K, e incubar o tubo durante a noite a 55 graus Celsius, com agitação suave. Após a incubação, deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente por cinco minutos. Para o isolamento do DNA do sangue, balance suavemente o tubo até que esteja completamente misturado.Em seguida, transfira sangue para um tubo de centrífuga de 15 mililitros estéril contendo nove mililitros de solução de lise celular. Inverta o tubo várias vezes durante um período de incubação de 10 minutos à temperatura ambiente. Centrífuga a 600g por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, descarte o máximo de supernasce possível sem perturbar a pelota branca visível. Vórtice o tubo vigorosamente por 15 segundos até que completamente resuspended. Adicione três mililitros de solução de lise nuclei e pipeta várias vezes, fazendo com que a solução se torne viscosa.Adicione tampão de precipitação proteica à amostra. Em seguida, vórtice vigorosamente por 20 segundos, e incuba-lo no gelo por cinco minutos. Centrífuga a 16.000g por quatro minutos para formar uma pelota apertada contendo as proteínas precipitadas.Transfira cuidadosamente o supernante sem perturbar a pelota para um novo tubo de 1,7 mililitro. Adicione um mililitro de 2-propanol ao tubo contendo o supernasal, e misture-o suavemente invertendo. O DNA deve se tornar visível como uma substância flutuante branca.Centrifugar a 16.000 vezes g por um minuto, e remover o supernatante completamente. Adicione um mililitro de 70% de etanol recém-preparado, e inverta o tubo várias vezes. Centrifuá-lo a 16.000g por um minuto à temperatura ambiente.Em seguida, descarte cuidadosamente o supernaspe. Repita a lavagem do etanol. Em seguida, deixe a pelota de DNA para secar o ar por 10 a 15 minutos.Adicione 50 microliters de água ultra-pura ao DNA, e realize a quantificação de DNA conforme descrito no manuscrito do texto. Use 150 nanogramas de DNA para preparar a biblioteca para sequenciamento. Coloque pipetas e pontas no capô com luz UV por 15 minutos para quebrar o DNA residual.Enquanto isso, permita que os diferentes tubos de índice e polimerase de DNA descongelem no gelo. Em uma capa biológica, adicione 45 microliters dos diferentes tubos de índice aos tubos PCR, tomando cuidado para evitar a contaminação cruzada. Em seguida, adicione 0,2 microliters da polimerase de DNA e cinco microliters do DNA preparado nos tubos PCR.Execute o PCR usando um programa predefinido de acordo com as instruções do fabricante. Use contas magnéticas para remoção de primers em excesso, nucleotídeos e enzimas. Aqueça as contas à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos, e prepare 80% de etanol fresco suficiente para 400 microliters por amostra.Adicione as contas a cada tubo PCR e misture por pipetar 10 vezes. Incubar os tubos por 10 minutos em temperatura ambiente. Coloque a amostra mista no suporte magnético por cinco minutos.Em seguida, aspire o líquido claro e descarte. Aspire o líquido restante usando uma ponta de 10 microliter. Adicione 200 microliters de 80% de etanol a cada amostra e incubar por 30 segundos.Aspirar 195 microliters de etanol, e descartar. Em seguida, aspire o líquido restante usando uma ponta de 10 microliter. Repita a lavagem do etanol.Em seguida, abra as tampas dos tubos, e deixe-os secar o ar por cinco minutos. Após cinco minutos, remova as amostras do suporte magnético e adicione 25 microliters de tampão de elução. Misture por pipetar até ficar homogêneo e incubar à temperatura ambiente por dois minutos.Coloque os tubos no suporte magnético por cinco minutos. Em seguida, transfira 22 microliters para um novo tubo PCR, e meça a concentração de DNA. Quantifique o amplicon como descrito no manuscrito do texto.Depois de calcular a concentração final de DNA e o tamanho em pares de base do pico do produto, prepare uma nova mistura de diluição para cada amostra e transfira dois microliters para uma nova mistura de piscina. Prepare uma solução fresca de hidróxido de sódio normal de 0,2 e adicione 10 microliters à biblioteca diluída. Incubar por cinco minutos à temperatura ambiente para desnaturar o DNA de dois fios.Em seguida, adicione 980 microliters de tampão pré-refrigerado do kit ao tubo contendo DNA, e vórtice brevemente. Carregue 600 microliters da biblioteca final no cartucho designado e coloque as amostras na máquina. Para realizar a análise de sequenciamento, baixe métricas de sequenciamento do sequenciador e verifique se os dados estão dentro das faixas apropriadas.Repita a execução para amostras que não atendam aos critérios. Este protocolo foi utilizado para realizar uma análise básica de amostras representativas de sangue autólogo e retal de um paciente com deficiência de receptor IL10 e histórico de IBD de início infantil grave. As amostras foram avaliadas tanto para o repertório TCR-beta quanto para o IGH.Todos os clones podem ser identificados por sua sequência única no nível nucleotídeo ou aminoácido. Essas sequências podem ser comparadas entre diferentes pacientes em busca de clones compartilhados ou no mesmo paciente entre diferentes locais anatômicos. Os cinco clones mais frequentes para cada amostra são mostrados aqui.As imagens do TreeMap foram geradas para uma visão geral ampla do repertório. Cada quadrado colorido representa um clone diferente, e o tamanho se correlaciona com sua frequência. Estas imagens do TreeMap demonstram expansão clonal no repertório IGH intestinal.Em contraste, no repertório TCR-beta, a expansão clonal marcada é observada no sangue em comparação com o intestino autólogo. No nível genético, o NGS fornece informações sobre o uso de V, D e J no nível de gene, família ou alelo. Além disso, combinações específicas de VDJ podem ser inferidas a partir dos dados para repertórios TCR-beta e IGH, revelando padrões diferenciais de uso de genes em várias condições.Este protocolo pode ser aplicado tanto no DNA quanto no RNA e pode ser usado para gerar repertórios TCR-alfa, TCR-gama e IGL. Também é compatível com outros órgãos após pequenas modificações de digestão.

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Immunology and Infection

Unit 1

The Lymphatic and Immune System

SCIENTISTS IN ACTION

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Imunologia e Infecção

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identificação de Mouse e repertórios de anticorpo humano por sequenciamento de próxima geração

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...