Name: t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00
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Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional del Sheba Medical Center, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos participantes.
1. Aislamiento y cuantificación del ADN
<ol><li>Digestión y lisis celular de biopsias intestinales<ol>
<li>Recuperar biopsias intestinales, ya sean recién recogidas o almacenadas a -20 °C u -80 °C. Si usa biopsias congeladas, descongele sobre hielo.</li>
		<li>Añadir 600 μL de solución de lisis de núcleos...

<ol>
	<li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V(D)J+recombination.">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, 45-55 (2002).</li><li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+Recombination:+Mechanism,+Errors,+and+Fidelity.">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire:+pitfalls+and+opportunities.">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li><li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools:+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses.">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency.">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD.">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia.">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).</li><li>Chapman, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases.">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+patients.">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li><li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases.">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li><li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn's+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence.">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/HighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling.">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333 (2013).</li><li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies:+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency.">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).</li><li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma.">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li><li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy.">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li><li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia.">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li><li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing:+Techniques+and+Future+Challenges.">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).</li><li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR.">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing.">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li></ol>

Los cambios en la abundancia y la función de los linfocitos B y T se encuentran a menudo en diferentes neoplasias malignas18,trastornos inflamatorios crónicos (por ejemplo, colitis ulcerosa y artritis reumatoide)10,19,y en diversas inmunodeficiencias17,20. El método actual utiliza NGS para facilitar una visión en profundidad de los repertorios de TCR y BCR, lo que permite la de...

El sistema inmune adaptante, comprendido de linfocitos de T y de B, utiliza memoria inmunológica para reconocer un antígeno previamente encontrado e iniciar una respuesta rápida. Los linfocitos se generan en la médula ósea y maduran en el timo (células T) o la médula ósea (células B). Tanto el receptor de células T (TCR) como el receptor de células B (BCR) muestran configuraciones únicas que permiten el reconocimiento de antígenos específicos. En la homeostasis, las células T y B circulan y examinan constantemente los billones de péptidos diferentes presentados en las células presentadoras de antígenos. La ligadura TCR o BCR de un antígeno específico con alta afinidad, junto con la coestimulación adecuada, conduce a la activación celular, lo que resulta en la secreción de citoquinas, la expansión clonal y la generación de anticuerpos, en el caso de las células B.
La enorme variedad de las diferentes células T o B se denomina colectivamente repertorio inmune, lo que permite el reconocimiento de innumerables epítopos diferentes. Para generar un repertorio tan vasto, se lleva a cabo un complejo proceso de ensamblaje aleatorio de diferentes segmentos de genes, creando combinaciones casi infinitas de receptores que pueden unirse a antígenos únicos1. Este proceso, denominado recombinación V(D)J, incluye reordenamientos de diferentes genes variables (V), diversidad (D) y unión (J), acompañados de deleciones aleatorias e inserciones de nucleótidos en las uniones2.
La arquitectura del sistema inmune adaptativo ha interesado a científicos en diferentes campos durante muchas décadas. En el pasado, la secuenciación de Sanger, la determinación complementaria de espectros de la región 3 (CDR3) y la citometría de flujo se utilizaron para caracterizar el repertorio inmunológico, pero proporcionaron baja resolución. En la última década, los avances en los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) permitieron una visión profunda de las características y la composición de los repertorios de TCR y BCR de un individuo3,4. Estos sistemas de alto rendimiento (HTS) secuencian y procesan millones de productos TCR o BCR reorganizados simultáneamente y permiten un análisis de alta resolución de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos. Ngs proporciona una nueva estrategia para estudiar el repertorio inmune en salud y enfermedad. Los estudios que utilizaron HTS demostraron repertorios alterados de TCR y BCR en enfermedades autoinmunes5,inmunodeficiencias primarias6,7,y malignidades, tales como en leucemia mieloide aguda8. Usando NGS, nosotros y otros hemos mostrado la extensión oligoclonal de las copias específicas de la célula de T y de B, en pacientes con la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD), incluyendo colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn9,10,11,12,13,14. En general, los estudios de diferentes campos sugieren que los cambios en el repertorio tienen un papel crucial en la patogénesis de los trastornos inmuno-mediados.
El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de las biopsias intestinales y la sangre, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para NGS, y la realización de la secuenciación de ejecución. También proporcionamos pasos básicos en el análisis de datos del repertorio inmunológico. Este protocolo también se puede aplicar para la generación de bibliotecas TCRα, TCRγ e IGL. El método también es compatible con otros órganos (por ejemplo, ganglios linfáticos, tumores, líquido sinovial, tejido graso, etc.) siempre y cuando se utilicen protocolos de digestión específicos de tejidos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>8187631104051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08543.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N8080241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Bioer</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td>For Tapestation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>For Tapestation. Tubes sold seperately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphotrack Assay kit</td>
			<td>Invivoscribe</td>
			<td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td>
			<td>Each includes 24 indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>Includes standard flow cell type and all reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra pure water</td>
			<td>Bio-lab</td>
			<td>7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard DNA isolation kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing

La memoria inmunológica, el sello distintivo de la inmunidad adaptativa, es orquestada por linfocitos T y B. En la circulación y diferentes órganos, hay miles de millones de clones únicos de células T y B, y cada uno puede unirse a un antígeno específico, lo que lleva a la proliferación, diferenciación y / o secreción de citoquinas. La gran heterogeneidad en las células T y B es generada por la recombinación aleatoria de diferentes segmentos genéticos. Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), desarrolladas en la última década, permiten una visión en profundidad sin precedentes del repertorio inmunológico de los receptores de células T y B. Los estudios en varias condiciones inflamatorias, inmunodeficiencias, infecciones y malignidades demostraron cambios marcados en clonality, uso del gen, y propiedades biofísicas del repertorio inmune, proporcionando penetraciones importantes sobre el papel de inmunorespuestas adaptante en diversos desordenes.
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para NGS del repertorio inmune de las células de T y de B de la sangre y del tejido. Presentamos una tubería a partir del aislamiento de ADN a través de la preparación de la biblioteca, la secuenciación en el secuenciador NGS y terminando con análisis básicos. Este método permite la exploración de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos, y por lo tanto puede identificar cambios dinámicos en las poblaciones de linfocitos y parámetros de diversidad en diferentes enfermedades. Esta técnica está entrando lentamente en la práctica clínica y tiene el potencial para la identificación de nuevos biomarcadores, estratificación de riesgos y medicina de precisión.

Adjunto, describimos un método para el aislamiento de la DNA del tejido y de la sangre intestinales, la preparación de las bibliotecas para ngs, y los pasos básicos de un funcionamiento de la secuenciación para la secuencia del repertorio inmune. La ejecución generará archivos fastq, que se pueden convertir en archivos fasta para su uso en la plataforma internacional ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST. Este HTS realiza y gestiona muchos análisis de decenas de miles de secuencias tcrβ y IGH reorganizadas, a nivel...

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T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de muestras de sangre y biopsias intestinales, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para la secuenciación de próxima generación, la realización de una ejecución de NGS y el análisis de datos básicos.

Análisis del repertorio inmune del receptor de células T y B mediante secuenciación de próxima generación

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

Este método permite la exploración de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos y, por lo tanto, puede identificar cambios dinámicos en las poblaciones de linfocitos y parámetros de diversidad en diferentes trastornos. La ventaja de la secuenciación de próxima generación es la capacidad de identificar clones únicos de células T o B y rastrearlos en diferentes sitios anatómicos o en diferentes individuos. Esto tiene el potencial para la identificación de nuevos biomarcadores en diversas enfermedades.Demostrando ese procedimiento estará Naomi Salamon, una asistente de investigación de mi laboratorio. Comience por realizar la digestión y la lisis celular de las biopsias intestinales. Recupere biopsias intestinales recién recolectadas o almacenadas a 20 u 80 grados centígrados negativos.Si usa biopsias congeladas, descongelarlas en hielo. Añadir 600 microlitros de solución de lisis de núcleos a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,7 mililitros, refrigerado sobre hielo. Luego coloque una biopsia en el tubo e incubarlo a 65 grados Celsius durante 15 a 30 minutos.Agregue 17.5 microlitros de 20 miligramos por mililitro proteinasa K, e incube el tubo durante la noche a 55 grados Celsius, con un temblor suave. Después de la incubación, deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante cinco minutos. Para el aislamiento del ADN de la sangre, mezcle suavemente el tubo hasta que se mezcle completamente.Luego transfiera sangre a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros que contiene nueve mililitros de solución de lisis celular. Invierta el tubo varias veces durante un período de incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. Centrífuga a 600g durante 10 minutos a temperatura ambiente.Luego deseche tanto sobrenadante como sea posible sin molestar el pellet blanco visible. Vórtice el tubo vigorosamente durante 15 segundos hasta que se resuspended por completo. Agregue tres mililitros de solución de lisis de núcleos y pipetee varias veces, haciendo que la solución se vuelva viscosa.Agregue tampón de precipitación de proteínas a la muestra. Luego vórtice vigorosamente durante 20 segundos, e incubarlo en hielo durante cinco minutos. Centrífuga a 16, 000g durante cuatro minutos para formar un pellet apretado que contiene las proteínas precipitadas.Transfiera cuidadosamente el sobrenadante sin molestar el pellet a un nuevo tubo de 1.7 mililitros. Agregue un mililitro de 2-propanol al tubo que contiene el sobrenadante y mézclelo suavemente invirtiendo. El ADN debe hacerse visible como una sustancia flotante blanca.Centrífuga a 16, 000 veces g durante un minuto, y retire el sobrenadante por completo. Agregue un mililitro de etanol al 70% recién preparado e invierta el tubo varias veces. Centrifugarlo a 16,000g durante un minuto a temperatura ambiente.A continuación, deseche cuidadosamente el sobrenadante. Repita el lavado de etanol. Luego deje que el pellet de ADN se seque al aire durante 10 a 15 minutos.Agregue 50 microlitros de agua ultra-pura al ADN y realice la cuantificación del ADN como se describe en el manuscrito del texto. Utilice 150 nanogramos de ADN para preparar la biblioteca para la secuenciación. Coloque pipetas y puntas en la campana con luz UV durante 15 minutos para descomponer el ADN residual.Mientras tanto, permita que los diferentes tubos de índice y adn polimerasa se descongele en el hielo. En una campana biológica, agregue 45 microlitros de los diferentes tubos índice a los tubos de PCR, teniendo cuidado de evitar la contaminación cruzada. A continuación, agregue 0,2 microlitros de la ADN polimerasa y cinco microlitros del ADN preparado en los tubos de PCR.Ejecute PCR utilizando un programa preestablecido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice perlas magnéticas para la eliminación del exceso de cebadores, nucleótidos y enzimas. Caliente las perlas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos y prepare suficiente etanol fresco al 80% para 400 microlitros por muestra.Agregue las perlas a cada tubo de PCR y mezcle pipeteando 10 veces. Incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Coloque la muestra mixta en el soporte magnético durante cinco minutos.Luego aspire el líquido claro y deseche. Aspirar el líquido restante usando una punta de 10 microlitros. Agregue 200 microlitros de etanol al 80% a cada muestra e incube durante 30 segundos.Aspirar 195 microlitros de etanol, y desechar. Luego aspire el líquido restante usando una punta de 10 microlitros. Repita el lavado de etanol.Luego abra las tapas de los tubos y déjelos secar al aire durante cinco minutos. Después de cinco minutos, retire las muestras del soporte magnético y agregue 25 microlitros de tampón de elución. Mezclar mediante pipeteo hasta que sea homogéneo, e incubar a temperatura ambiente durante dos minutos.Coloque los tubos en el soporte magnético durante cinco minutos. Luego transfiera 22 microlitros a un nuevo tubo de PCR y mida la concentración de ADN. Cuantifique el amplicon como se describe en el manuscrito del texto.Después de calcular la concentración final de ADN y el tamaño en pares de bases del pico del producto, prepare una nueva mezcla de dilución para cada muestra y transfiera dos microlitros de la misma a una nueva mezcla de piscina. Prepare una solución fresca de 0,2 hidróxido de sodio normal y agregue 10 microlitros a la biblioteca diluida. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar el ADN de doble cadena.Luego agregue 980 microlitros de tampón pre-refrigerado del kit al tubo que contiene ADN y vórtice brevemente. Cargue 600 microlitros de la biblioteca final en el cartucho designado y coloque las muestras en la máquina. Para realizar el análisis de secuenciación, descargue las métricas de secuenciación del secuenciador y compruebe que los datos están dentro de los intervalos adecuados.Repita la ejecución para los ejemplos que no cumplen los criterios. Este protocolo fue utilizado para realizar un análisis básico de la sangre autóloga representativa y de las muestras rectales de un paciente con deficiencia del receptor IL10 y una historia del infantil-inicio severo IBD. Las muestras fueron probadas para el repertorio TCR-beta y IGH.Todos los clones pueden ser identificados por su secuencia única a nivel de nucleótidos o aminoácidos. Estas secuencias se pueden comparar entre diferentes pacientes en busca de clones compartidos o en el mismo paciente entre diferentes sitios anatómicos. Los cinco clones más frecuentes para cada muestra se muestran aquí.Se generaron imágenes de TreeMap para una amplia visión general del repertorio. Cada cuadrado de color representa un clon diferente, y el tamaño se correlaciona con su frecuencia. Estas imágenes de TreeMap demuestran la extensión clónica en el repertorio intestinal de IGH.En cambio, en el repertorio TCR-beta, la extensión clónica marcada se observa en la sangre en comparación con el intestino autólogo. A nivel de genes, NGS proporciona información sobre el uso de V, D y J a nivel de cualquier gen, familia o alelo. Por otra parte, las combinaciones específicas de VDJ se pueden inferir de los datos para los repertorios TCR-beta y IGH, revelando patrones diferenciados del uso del gen en varias condiciones.Este protocolo se puede aplicar en la DNA y el ARN y se puede utilizar para generar la TCR-alfa, la TCR-gamma, y los repertorios de IGL. También es compatible con otros órganos después de ligeras modificaciones de digestión.

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Immunology and Infection

Unit 1

The Lymphatic and Immune System

SCIENTISTS IN ACTION

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Investigación

Inmunología e Infección

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Protocolo Aislamiento eficiente para B y linfocitos T a partir Humanos Palatine amígdalas

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

El uso de cristalografía de rayos X, Biofísica y Ensayos funcionales para determinar la célula T mecanismos que rigen el reconocimiento del receptor de antígenos del cáncer

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identificación de ratón y anticuerpos humanos repertorios por secuenciación de próxima generación

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Estudio de la dinámica de los organelos en células B durante la formación de la sinapsis inmune

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...