Name: t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing at JoVE.com

Bu çalışma Sheba Tıp Merkezi'ndeki kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve tüm katılımcı konulardan yazılı onay alınmıştır.
1. DNA izolasyonu ve nicelleştirme
<ol><li>Bağırsak biyopsilerinin sindirimi ve hücre lizisi<ol>
<li>Yeni toplanan veya -20 °C veya -80 °C'de depolanan bağırsak biyopsilerini alın. Donmuş biyopsi kullanıyorsanız, buzda çözün.</li>
		<li>Buz üzerinde soğutulmuş steril 1,7 mL mikro santrifüj tüpüne 600 μL çekirdek liziz ?...

<ol>
	<li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V(D)J+recombination.">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, 45-55 (2002).</li><li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+Recombination:+Mechanism,+Errors,+and+Fidelity.">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li><li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire:+pitfalls+and+opportunities.">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li><li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools:+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses.">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+repertoire+analysis+in+polygenic+autoimmune+diseases.">Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases.</a> Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).</li><li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency.">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD.">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia.">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).</li><li>Chapman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T-cell+Receptor+Repertoire+in+Inflamed+Tissues+of+Patients+with+Crohn's+Disease+Through+Deep+Sequencing.">Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).</li><li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+receptor+beta+repertoire+patterns+in+pediatric+ulcerative+colitis.">Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).</li><li>Bashford-Rogers, R. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases.">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn's+disease+and+ulcerative+colitis+patients.">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li><li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases.">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li><li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn's+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence.">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/HighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling.">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333 (2013).</li><li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies:+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency.">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).</li><li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency:+a+review.">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li><li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy.">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis.">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li><li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders:+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing.">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li><li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+towards+personalized+immunology.">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).</li><li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors.">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).</li><li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma.">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li><li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy.">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li><li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia.">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li><li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing:+Techniques+and+Future+Challenges.">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).</li><li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR.">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing.">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li></ol>

B ve T lenfositlerinin bolluğunda ve işlevinde değişikliklere genellikle farklı malignitelerde rastlanır18, kronik inflamatuar bozukluklar (örneğin, ülseratif kolit ve romatoid artrit)10,19ve çeşitli immün yetmezliklerde17,20. Mevcut yöntem, TCR ve BCR repertuarlarının derinlemesine görünümünü kolaylaştırmak için NGS'yi kullanır, T ve B hücre klonalitesinde...

T ve B lenfositlerden oluşan adaptif bağışıklık sistemi, daha önce karşılaşılan bir antijeni tanımak ve hızlı bir yanıt başlatmak için immünolojik hafızayı kullanır. Lenfositler kemik iliğinde üretilir ve timusta (T hücreleri) veya kemik iliğinde (B hücreleri) olgunlaşır. Hem T hücre reseptörü (TCR) hem de B hücre reseptörü (BCR), belirli antijenlerin tanınmasını sağlayan benzersiz konfigürasyonlar görüntüler. Homeostazda, T ve B hücreleri antijen sunan hücrelerde sunulan trilyonlarca farklı peptidi sürekli dolaşıma sokar ve inceler. Yüksek benzeşimli belirli bir antijenin TCR veya BCR ligasyonu, uygun ko-stimülasyon ile birlikte hücre aktivasyonuna yol açar ve B hücreleri durumunda sitokin salgılanması, klonal genişleme ve antikorların üretilmesine neden olur.
Farklı T veya B hücrelerinin muazzam dizisi, sayısız farklı epitopun tanınmasını sağlayan toplu olarak bağışıklık repertuarı olarak adlandırılmıştır. Böylesine geniş bir repertuar oluşturmak için, farklı gen segmentlerinin rastgele montajının karmaşık bir süreci gerçekleşir ve benzersiz antijenleri bağlayabilen reseptörlerin neredeyse sonsuz kombinasyonları oluşturulur1. V(D)J rekombinasyonu olarak adlandırılan bu işlem, kavşaklarda rastgele silmeler ve nükleotid eklemeleri eşliğinde farklı değişken (V), çeşitlilik (D) ve birleştirme (J) genlerinin yeniden düzenlenmesini içerir2.
Adaptif bağışıklık sisteminin mimarisi, bilim insanlarını uzun yıllardır farklı alanlarda ilgilendirmektedir. Geçmişte, Sanger dizilimi, tamamlayıcı belirleyici bölge 3 (CDR3) spektratilleme ve akış sitometrisi bağışıklık repertuarını karakterize etmek için kullanıldı, ancak düşük çözünürlük sağladı. Son on yılda, yeni nesil dizileme (NGS) yöntemlerindeki gelişmeler, bireyin TCR ve BCR repertuarlarının özellikleri ve kompozisyonu hakkında derinlemesine içgörü sağladı3,4. Bu yüksek verimli sistemler (HTS) milyonlarca yeniden düzenlenmiş TCR veya BCR ürününü aynı anda sıralar ve işler ve nükleotid veya amino asit seviyesindeki belirli T ve B hücrelerinin yüksek çözünürlüklü analizine izin verir. NGS, hem sağlık hem de hastalıkta bağışıklık repertuarını incelemek için yeni bir strateji sağlar. HTS kullanılarak yapılan çalışmalarda otoimmün hastalıklar5,primer immün yetmezlikler6,7ve akut miyeloid lösemi8gibi malignitelerde değişen TCR ve BCR repertuarları gösterilmiştir. NGS kullanarak, biz ve diğerleri, ülseratifkolit ve Crohn hastalığı 9 , 10 , 11, 12,13,14dahil olmak üzere enflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) olan hastalarda spesifik T ve B hücre klonlarının oligoklonal genişlemesini gösterdik. Genel olarak, farklı alanlardan yapılan çalışmalar, repertuardaki değişikliklerin bağışıklık aracılı bozuklukların patogenezinde çok önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir.
Mevcut protokol, DNA'nın bağırsak biyopsilerinden ve kanından izole edilmesini, NGS için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretilmesini ve sıralama çalışmasının performansını açıklar. Ayrıca bağışıklık repertuar veri analizinde temel adımlar sağlıyoruz. Bu protokol TCRα, TCRφ ve IGL kitaplıklarının üretimi için de uygulanabilir. Yöntem, dokuya özgü sindirim protokolleri kullanıldığı sürece diğer organlarla (örneğin lenf düğümleri, tümörler, sinovyal sıvı, yağ dokusu vb.) uyumludur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>8187631104051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08543.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N8080241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Bioer</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td>For Tapestation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>For Tapestation. Tubes sold seperately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphotrack Assay kit</td>
			<td>Invivoscribe</td>
			<td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td>
			<td>Each includes 24 indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td>Includes standard flow cell type and all reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra pure water</td>
			<td>Bio-lab</td>
			<td>7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard DNA isolation kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td>Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t and b cell receptor immune repertoire analysis using next-generation sequencing

Adaptif bağışıklığın ayırt edici özelliği olan immünolojik hafıza, T ve B lenfositleri tarafından düzenlenmiştir. Dolaşımda ve farklı organlarda milyarlarca benzersiz T ve B hücre klonu vardır ve her biri belirli bir antijeni bağlayarak çoğalmaya, farklılaşmaya ve/veya sitokin salgılanmasına yol açabilir. T ve B hücrelerindeki geniş heterojenlik, farklı genetik segmentlerin rastgele rekombinasyonu ile oluşur. Son on yılda geliştirilen yeni nesil dizileme (NGS) teknolojileri, T ve B hücre reseptör immün repertuarının eşi görülmemiş bir derinlemesine görünümünü sağlıyor. Çeşitli inflamatuar durumlar, immün yetmezlikler, enfeksiyonlar ve malignitelerde yapılan çalışmalar, bağışıklık repertuarının klonalite, gen kullanımı ve biyofiziksel özelliklerinde belirgin değişiklikler göstererek, adaptif immün yanıtların farklı bozukluklardaki rolü hakkında önemli bilgiler sağlamıştır.
Burada, kan ve dokudan T ve B hücrelerinin bağışıklık repertuarının NGS için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kütüphane hazırlığı, NGS sıralayıcı üzerinde sıralama ve temel analizlerle biten DNA izolasyonundan başlayarak bir boru hattı sunuyoruz. Bu yöntem, nükleotid veya amino-asit düzeyinde spesifik T ve B hücrelerinin araştırılmasını sağlar ve böylece lenfosit popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri ve farklı hastalıklardaki çeşitlilik parametrelerini tanımlayabilir. Bu teknik yavaş yavaş klinik uygulamaya giriyor ve yeni biyobelirteçlerin tanımlanması, risk tabakalaşması ve hassas tıp potansiyeline sahip.

Burada, bağırsak dokusu ve kandan DNA izolasyonu, NGS için kütüphanelerin hazırlanması ve bağışıklık repertuar dizilimi için bir sıralama çalışmasının temel adımları için bir yöntem açıklıyoruz. Çalıştırma, uluslararası ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST platformunda kullanılmak üzere fasta dosyalarına daha fazla dönüştürülebilen fastq dosyaları oluşturacaktır. Bu HTS, nükleotid seviyesi15'teon binlerce yeniden düzenlenmiş TCRβ ve IGH dizisinin birçok ...

Watch this Scientific Journal Video about T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing at JoVE.com

T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

Mevcut protokol, kan örnekleri ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu, yeni nesil sıralama için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretimi, bir NGS çalışmasının performansı ve temel veri analizi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

Bu yöntem, nükleotid veya amino asit düzeyinde spesifik T ve B hücrelerinin araştırılmasını sağlar ve böylece lenfosit popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri ve farklı bozukluklardaki çeşitlilik parametrelerini tanımlayabilir. Yeni nesil dizilemenin avantajı, benzersiz T veya B hücre klonlarını tanımlama ve farklı anatomik bölgelerde veya farklı bireylerde izleme yeteneğidir. Bu, çeşitli hastalıklarda yeni biyobelirteçlerin tanımlanması potansiyeline sahiptir.Bu prosedürü gösteren Naomi Salamon, laboratuvarımdan bir araştırma asistanı. Bağırsak biyopsilerinin sindirimini ve hücre lizizini yaparak başlayın. Bağırsak biyopsilerini taze toplanmış veya negatif 20 veya negatif 80 santigrat derecede depolanmış olarak alın.Donmuş biyopsi kullanıyorsanız, buzda çözün. Buz üzerinde soğutulmuş steril 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 600 mikrolitre çekirdek liziz çözeltisi ekleyin. Daha sonra tüpe bir biyopsi yerleştirin ve 15 ila 30 dakika boyunca 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Mililitre başına 20 miligram proteinaz K'den oluşan 17,5 mikrolitre ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak 55 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, numunenin beş dakika boyunca oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Kandan DNA izolasyonu için, tüpü iyice karışana kadar hafifçe sallayın.Daha sonra kanı dokuz mililitre hücre liziz çözeltisi içeren steril 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka süresi boyunca tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600g'de santrifüj.Ardından, görünür beyaz peletin rahatsız edilmeden mümkün olduğunca fazla süpernatant atın. Tüpü tamamen yeniden depolanıncaya kadar 15 saniye boyunca kuvvetlice vorteks edin. Üç mililitre çekirdek liziz çözeltisi ve pipet birkaç kez ekleyerek çözeltinin viskoz hale gelmesine neden olun.Numuneye protein çökeltme tamponu ekleyin. Sonra 20 saniye boyunca güçlü bir şekilde girdaplayın ve beş dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Çökemiş proteinleri içeren sıkı bir pelet oluşturmak için dört dakika boyunca 16.000g'de santrifüj.Peletin rahatsız edilmeden süpernatant'ı yeni bir 1,7 mililitrelik tüpe dikkatlice aktarın. Süpernatant içeren tüpe bir mililitre 2 propanol ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın. DNA beyaz yüzen bir madde olarak görünür hale gelmelidir.Bir dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj ve süpernatantı tamamen çıkarın. Bir mililitre taze hazırlanmış% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında bir dakika boyunca 16.000g'de santrifüj edin.Sonra süpernatant dikkatlice atın. Etanol yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra DNA peletini 10 ila 15 dakika boyunca havayla kurumaya bırakın.DNA'ya 50 mikrolitre ultra saf su ekleyin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi DNA nicelemesi gerçekleştirin. Kütüphaneyi sıralamaya hazırlamak için 150 nanogram DNA kullanın. Artık DNA'yı parçalamak için 15 dakika boyunca UV ışıklı kaputun içine pipetler ve uçlar yerleştirin.Bu arada, farklı indeks tüplerinin ve DNA polimerazlarının buzda çözülmesine izin verin. Biyolojik bir başlıkta, çapraz kontaminasyonu önlemeye dikkat ederek, farklı indeks tüplerinden PCR tüplerine 45 mikrolitre ekleyin. Daha sonra PCR tüplerine 0,2 mikrolitre DNA polimeraz ve hazırlanan DNA'nın beş mikrolitresini ekleyin.PCR'yi üreticinin talimatlarına göre önceden ayarlanmış bir program kullanarak çalıştırın. Fazla astarların, nükleotitlerin ve enzimlerin uzaklaştırılması için manyetik boncuklar kullanın. Boncukları oda sıcaklığına en az 30 dakika ısıtın ve numune başına 400 mikrolitre için yeterli taze% 80 etanol hazırlayın.Boncukları her PCR tüpüne ekleyin ve 10 kez pipetleme yaparak karıştırın. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Karışık numuneyi beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin.Sonra berrak sıvıyı epire edin ve atın. Kalan sıvıyı 10 mikroliter ucu kullanarak emiş edin. Her numuneye %80 etanolden oluşan 200 mikrolitre ekleyin ve 30 saniye kuluçkaya yatırın.195 mikrolitre etanol epire edin ve atın. Daha sonra kalan sıvıyı 10 mikroliter ucu kullanarak aspire edin. Etanol yıkamayı tekrarlayın.Sonra tüplerin kapaklarını açın ve beş dakika boyunca havayla kurumasına izin verin. Beş dakika sonra, örnekleri manyetik standdan çıkarın ve 25 mikrolitre elution tamponu ekleyin. Homojen olana kadar pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın.Tüpleri beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. Daha sonra 22 mikrolitreyi yeni bir PCR tüpüne aktarın ve DNA konsantrasyonu ölçün. Metin el yazmasında açıklandığı gibi amplicon'un ölçülmesi.Son DNA konsantrasyonunu ve ürünün zirvesinin taban çiftlerindeki boyutu hesaplandıktan sonra, her örnek için yeni bir seyreltme karışımı hazırlayın ve iki mikrolitresini yeni bir havuz karışımına aktarın. 0,2 normal sodyum hidroksit taze bir çözelti hazırlayın ve seyreltilmiş kütüphaneye 10 mikrolitre ekleyin. Çift iplikli DNA'yı yok etmek için oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatır.Daha sonra kitten DNA içeren tüpe 980 mikrolitre önceden soğutulmuş tampon ekleyin ve kısaca girdap ekleyin. Son kütüphanenin 600 mikrolitresini belirlenen kartuşa yükleyin ve numuneleri makineye yerleştirin. Sıralama çözümlemesi yapmak için sıralayıcıdan sıralama ölçümlerini indirin ve verilerin uygun aralıklarda olduğunu doğrulayın.Ölçütlere uymayan örnekler için çalıştırmayı yineleyin. Bu protokol, IL10 reseptör eksikliği ve şiddetli infantil başlangıçlı IBD öyküsü olan bir hastanın temsili otolog kan ve rektal örneklerinin temel analizini yapmak için kullanılmıştır. Örnekler hem TCR-beta hem de IGH repertuarı için test edildi.Tüm klonlar nükleotid veya amino asit seviyesindeki benzersiz dizileriyle tanımlanabilir. Bu diziler, paylaşılan klon arayışındaki farklı hastalar arasında veya aynı hastada farklı anatomik bölgeler arasında karşılaştırılabilir. Her örnek için en sık kullanılan beş klon burada gösterilmiştir.TreeMap görüntüleri, repertuara geniş bir genel bakış için oluşturulmuştu. Her renkli kare farklı bir klonu temsil eder ve boyut sıklığıyla ilişkilidir. Bu TreeMap görüntüleri bağırsak IGH repertuarında klonal genişleme göstermektedir.Buna karşılık, TCR-beta repertuarında, otolog bağırsağı ile karşılaştırıldığında kanda belirgin klonal genişleme gözlenir. Gen düzeyinde NGS, gen, aile veya alele düzeyinde V, D ve J kullanımı hakkında bilgi sağlar. Ayrıca, TCR-beta ve IGH repertuarlarının verilerinden belirli VDJ kombinasyonları çıkarılabilir ve çeşitli koşullarda diferansiyel gen kullanım kalıpları ortaya çıkarılabilir.Bu protokol hem DNA hem de RNA'da uygulanabilir ve TCR-alfa, TCR-gama ve IGL repertuarları oluşturmak için kullanılabilir. Hafif sindirim modifikasyonlarından sonra diğer organlarla da uyumludur.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

The Lymphatic and Immune System

SCIENTISTS IN ACTION

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Aktin ve Mikrotubul Cytoskeletons uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi kullanarak B-hücre bağışıklık sinaps, görselleştirme

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...