Name: measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products
Uploaded: 2020-12-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products at JoVE.com

Vi er Frank Yates meget taknemmelige for hans dyrebare råd. Dette arbejde blev støttet af Sup'Biotech.

1. Podning af inocula
<ol><li>Før forsøget lå 5 μL Trichoderma spp. SBT10-2018 sporer oplagret ved 4 °C på kartoffeldextrose agar medium (PDA) og inkuberes i 4 dage ved 30 °C med regelmæssig lyseksponering for at fremme conidiadannelse42 (Figur 1, panel A). BEMÆRK: Trichoderma spp. SBT10-2018 er blevet isoleret fra træ og bruges som model i denne undersøgelse for sin hurtige vækst og lette sporegenvinding. Denne stamme er bevaret af ...

Den fremgangsmåde, der præsenteres her, giver mulighed for evaluering af svampedræbende egenskaber ved minimalt forarbejdede plantebaserede produkter. I denne protokol opnås homogen fordeling af sporer på agaroverfladen ved hjælp af 2 mm glasperler. Dette trin kræver håndtering færdigheder til korrekt at distribuere perler og for at opnå reproducerbare resultater, i sidste ende gør det muligt at sammenligne svampedræbende virkninger på forskellige stadier af svampevækst. Vi fandt ud af, at 5 mm glasperler e...

Globale tab af frugt og grøntsager kan nå op til 50% af produktionen1 og skyldes hovedsagelig mad henfald forårsaget af svampe fordærv i marken eller under post-høst opbevaring2,3, på trods af den omfattende beskæftigelse af syntetiske fungicider siden midten af det tyvende århundrede4. Anvendelsen af disse stoffer tages op til fornyet overvejelse, da det udgør alvorlige miljø- og sundhedsrisici. Da de skadelige konsekvenser af deres anvendelse viser sig i hele økosystemerne , og der er indsamlet dokumentation for potentielle sundhedsmæssige virkninger5,6, udvikles der nye alternativer til gamle profylaktiske strategier til behandling før og efterhøsten 7,8,9. Derfor er den udfordring, vi står over for, dobbelt. Nye svampedræbende strategier skal for det første opretholde niveauet for fødevaresikkerhed mod fytopatogener og samtidig bidrage til en drastisk reduktion af landbrugspraksissens miljømæssige fodaftryk. For at opfylde dette ambitiøse mål foreslås strategier inspireret af det naturlige forsvar udviklet i planter, da mere end 1000 plantearter er blevet fremhævet for deres antimikrobielle egenskaber8. For eksempel er planter, der har udviklet naturlige fungicider til bekæmpelse af fytopathogens, en ny ressource i at udforske udviklingen af nye biokontrolprodukter2. Æteriske olier er flagskib molekyler af denne type. For eksempel beskytter Origanum æterisk olie tomatplanter mod grå skimmelsvamp i drivhuse 10 og Solidago canadensis L. og cassia æteriske olier har vist sig at bevare post-høstede jordbær fra grå skimmel skader11,12. Disse eksempler illustrerer, at biokontrol og især plantebaserede produkter udgør en løsning, der kombinerer biologisk effektivitet og miljømæssig bæredygtighed.
Således er planter en vigtig ressource af molekyler af potentiel interesse for afgrødebeskyttelsesindustrien. Der er imidlertid kun foreslået en håndfuld planteprodukter, der skal anvendes som biokontrolprodukter, selv om de generelt anerkendes som sikre, ikke-fytotoksiske og miljøvenlige2. Der er konstateret visse vanskeligheder i forbindelse med gennemførelsen fra laboratoriet til marken , f.eks. Således bliver det vigtigt at forbedre muligheden for lab tests til bedre at forudsige felteffektivitet. I denne forbindelse er svampedræbende testmetoder for planteafledte produkter nødvendige både for at evaluere deres svampedræbende virkning og for at definere deres optimale anvendelsesbetingelser. Specifikt er biokontrolprodukter generelt mindre effektive end kemiske fungicider, så en bedre forståelse af deres virkningsmåde er vigtig for at foreslå passende formuleringer, identificere anvendelsesmåden på områder og definere, hvilken udviklingsstadium af patogenet der er sårbar over for kandidatbioproduktet.
De nuværende metoder til antibakterielle og svampedræbende aktiviteter omfatter diffusionsmetoder såsom diffusion af agardisketter, fortynding, bioautografi og flowcytometri13. De fleste af disse teknikker, og mere specifikt, standard antifungal modtagelighed test - agar-disk diffusion og fortynding assays - er velegnede til vurdering af antimikrobiel aktivitet opløselige forbindelser på bakterielle og svampesporer i flydende suspensioner14. Disse metoder er dog generelt ikke egnede til at teste faste forbindelser såsom tørret plantepulver eller til at kvantificere svampedræbende aktivitet under myceliumvækst, da de kræver sporefortynding eller sporespredning på agarplader og / eller fortynding af svampedræbende forbindelser13. I den fødevaregiftede metode podes agarplader, der indeholder svampedræbende middel, med en 5-7 mm diameter disk udtaget fra en 7-dages gammel svampekultur uden at overveje den nøjagtige mængde start mycelium. Efter inkubation bestemmes svampedræbende aktivitet som en procentdel af radialvæksthæmning17,18,19. Med denne tilgang kan vi evaluere svampedræbende aktivitet på mycelial vækst. Derimod udføres agarfortyndingsmetoden for at bestemme svampedræbende aktivitet på sporer, der er direkte podet på overfladen af agarpladen, der indeholder svampedræbende forbindelser13,20,21. Disse to tilgange giver komplementære resultater med antifungal aktivitet. Men disse er to uafhængige teknikker, der anvendes parallelt, som ikke giver nøjagtig side-by-side sammenligning af den relative effekt af svampedræbende forbindelser på sporer og mycelium17,20,22 da mængden af startvalsemateriale varierer i de to tilgange. Desuden skyldes den svampedræbende aktivitet af et planteafledt produkt ofte kombinationen af svampedræbende molekyler syntetiseret af planter til ansigt patogener. Disse molekyler omfatter proteiner, peptider23,24, og metabolitter med bred kemisk diversitet og tilhører forskellige klasser af molekyler såsom polyfenoler, terpener, alcaloïds25, glucosinolater8, og organosulfurforbindelser26. Nogle af disse molekyler er flygtige eller bliver flygtige under patogenangreb27. Disse midler er oftest dårligt vandopløselige og højdamptryksforbindelser, der skal genvindes gennem vanddestillation som æteriske olier, hvoraf nogle antimikrobielle aktiviteter er veletablerede.28. Dampfase medieret modtagelighed assays er blevet udviklet til at måle antimikrobiel aktivitet af flygtige forbindelser efter fordampning og migration via damp fase29. Disse metoder er baseret på indførelsen af svampedræbende forbindelser i en afstand fra den mikrobielle kultur29,30,31,32,33. I den almindeligt anvendte dampfase agaranalyse deponeres æteriske olier på en papirdisk og placeres i midten af dækslet af petriskålen i afstand fra bakteriel eller svampesporeaffjedring, som spredes på agar medium. Diameteren af væksthæmmende zone måles derefter på samme måde som for agar-disk diffusionsmetoden20,24. Der er udviklet andre metoder til kvantitativ måling af æteriske oliers antifungale modtagelighed i dampfasen, der stammer fra bouillonfortyndingsmetoden, hvorfra der blev beregnet en hæmmende dampfasemedieret antimikrobiel aktivitet.32, eller fremstillet af diffusionsanalyser af agar-disk31. Disse metoder er generelt specifikke for dampfaseaktivitetsundersøgelser og ikke egnede til kontakthæmmende assays. Dette udelukker bestemmelse af det relative bidrag fra flygtige og ikke-flygtige stoffer til svampedræbende aktivitet i en kompleks bioaktiv blanding.
Den kvantitative metode, vi har udviklet, har til formål at måle den svampedræbende virkning af tørret plantepulver på kontrollerede mængder sporer og dyrket mycelium deponeret på overfladen af et agarmedium for at reproducere luftvæksten af fytopathogens under infektion af planter15 samt et sammenkoblet mycelialt netværk16. Tilgangen er en modificeret eksperimentel opsætning baseret på agarfortynding og fødevaregifte metoder, der også i samme eksperimentelle opsætning muliggør side om side kvantificering af bidraget fra både flygtige og ikke-flygtige svampedræbende metabolitter. I denne undersøgelse er metoden blevet benchmarket mod aktiviteten af tre velkaraktererede svampedræbende præparater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave-vacuclav 24B+</td>
			<td>Melag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbendazim</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>378674-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>547254</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five millimeters diameter stainless steel tube</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food dehydrator</td>
			<td>Sancusto</td>
			<td></td>
			<td>six trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic powder</td>
			<td>Organic shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>CLOUP</td>
			<td>65020</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer counting cell</td>
			<td>Jeulin</td>
			<td>713442</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&#160;UM400</td>
			<td>30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife mill</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>TSM6A013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>HCNT-001-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring ruler</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinets</td>
			<td>FASTER</td>
			<td></td>
			<td>FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014407</td>
			<td>100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014411</td>
			<td>20 - 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014412</td>
			<td>2 - 20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1194500</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1473&#160;</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controllers-EASY 60</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>EASY-P60-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>70139-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale-RADWAG</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>B126698</td>
			<td>AS220.R2-ML 220g/0.1mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rake</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86-1569001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse microscope AE31E trinocular</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>M097917</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile graduated pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>1254001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymus essential oil</td>
			<td>Drugstore</td>
			<td></td>
			<td>Essential oil 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.762010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth pick</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichoderma spp strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strain of LRPIA laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>FORS-001-002</td>
			<td>/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products

Den beskrevne protokol er baseret på en plug-transfer-teknik, der giver mulighed for nøjagtig bestemmelse af mikroorganismemængder og deres udviklingsstadier. Et bestemt antal sporer spredes på en agarplade. Denne agarplade inkuberes i en bestemt periode, så svampene kan nå det forventede udviklingsstadium, undtagen sporer, hvor inkubation ikke er påkrævet. Agar stik dækket af sporer, hyphae, eller mycelium er næste trukket tilbage og overføres til agar medier, der indeholder svampedræbende forbindelse, der skal testes enten placeret i en afstand fra svampe eller i kontakt. Denne metode anvendes til test af både flydende ekstrakter og faste prøver (pulvere). Det er især velegnet til at kvantificere de relative bidrag fra flygtige og ikke-flygtige stoffer i bioaktive blandinger og til bestemmelse af deres virkninger, specielt på sporer, tidlig hyphae og mycelium.
Metoden er yderst relevant for karakteriseringen af biokontrolprodukters svampedræbende aktivitet, navnlig planteafledte produkter. Til plantebehandling kan resultaterne faktisk bruges til at vejlede valget af anvendelsesmåde og til at fastsætte udløsertærsklerne.

For at evaluere den kvantitative metodes evne til at diskriminere virkningsmåden for forskellige typer svampemidler, sammenlignede vi effekten af tre velkendte svampemidler. Carbendazim er et ikke-flygtigt syntetisk fungicid , som i vid udstrækning er blevet anvendt til at kontrollere en bred vifte af svampesygdomme i planter39,40. Thymus vulgaris æterisk olie er i vid udstrækning blevet beskrevet for sin antibakterielle og svampedræbende aktivitet ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products at JoVE.com

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Vi beskriver en modificeret agarbaseret metode designet til at kvantificere de svampedræbende virkninger af plantebaserede produkter. Både volatile og ikke-volatile bidrag til svampeaktiviteten kan vurderes ved hjælp af denne protokol. Derudover kan effekten mod svampe måles på centrale udviklingsstadier i et enkelt eksperimentelt setup.

Måling af biocontrolprodukters flygtige og ikke-flygtige svampedræbende aktivitet

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

This protocol provides a method for making accurate side-by-side comparisons of the relative efficacy of volatile and non-volatile antifungal compounds at different fungal growth stages. This method is well-suited for evaluating the antifungal activity of plant-derived products used in dried or liquid forms that contain a wide diversity of molecules. This method can provide valuable information about the mode of application of plant-derived products and is particularly well-suited in the field of biocontrol.Demonstrating the procedure will be Valentina Gligorijevic, an engineer assistant from the Sup'Biotech laboratory. For conidia collection, layer three milliliters of 0.05%Tween 20 on a trichoderma mycelium culture and use a rake to release the conidia from the conidiophores taking care not to press down on the mycelium to prevent the hyphae from being torn away. When all of the conidia have been released, use a micropipette to quickly recover and add the conidia solution to a 15 milliliter tube for counting.To prepare fungal plates, deposit 100 microliters of spores at a three times 10 to the six spores per milliliter concentration onto a nine centimeter Petri dish containing PDA medium, and use a sterile spatula to add 10 grams of two millimeter diameter glass beads to the plate. Then gently shake the plate forward and backward and spin and rotate the plate in 90 degree segments until it has been fully rotated to evenly distribute the spores across the surface of the agar. Then incubate the plate at 30 degrees Celsius until growth inhibition analysis.To perform a contact-inhibition assay with garlic powder, use a sterile spatula to weigh the desired garlic powder quantity into individual 50 milliliter tubes. to obtain concentrations generally ranging from 0.25 to 16 milligrams per milliliter. Add 10 milliliters of approximately 45 degrees Celsius PDA to each tube and carefully invert each tube several times to evenly distribute the powder throughout the agar.Quickly, pour the homogenized suspensions into five centimeter diameter Petri dishes and allow the agar to solidify at room temperature. To perform a contact-inhibition assay, use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the agar in the control and antifungal compound-treated dishes, and use a sterile toothpick to dispose of the agar cylinders. Next, use a new five millimeter diameter stainless steel tube to plot 15 to 20 circles randomly into the fungal plates, and use sterile toothpicks to carefully transfer the spore, hyphae, or mycelium-covered cylinders into the empty regions of the PDA plates.Then return the plates to the 30 degree Celsius incubator. To prepare a plates for a vapor-phase antifungal inhibition assay, pour 10 milliliters of PDA medium into the lid of a five centimeter diameter Petri dish containing 10 milliliters of PDA medium containing antifungal compounds or PDA medium alone, and allow the agar to solidify at room temperature. Using a 50 milliliter centrifical tube as a calibration tool, make a circle of PDA in the center of the agar and use a sterile spatula to remove the agar around the circle.Use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the medium in the lid and use a sterile toothpick to discard the auger cylinder. Then use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to randomly make plugs in the prepared fungal plates, and use a sterile toothpick to carefully transfer spore, hyphae, or mycelium-coated plugs into the lids of the assay plates. In this analysis, trichoderma species SBT 10-2018 growth inhibition triggered by three antifungal compounds was evaluated using contact and vapor-phase inhibition assays as demonstrated for each fungal stage.A higher spore sensitivity to carbendazim was observed compared to early hyphae and mycelium networks when trichoderma and antifungal compounds were in contact. In contrast, carbendozim had no antifungal effect on trichoderma when the fungus was placed at a distance from the fungicide in accordance with the low volatility of this substance. When thymus vulgaris essential oil was used as an antifungal compound, a higher sensitivity was observed for spores and early hyphae as compared to mycelium growth inhibition at 0.025%essential oil.As expected, thymus vulgaris essential oil presented identical antifungal activity irrespective of the distance between the fungus and the oil. When garlic powder was used, a higher efficacy was observed against spore germination and early hyphae elongation than for mycellium growth. Particular attention must be paid during the fungal plate preparation to make sure that the spores are evenly distributed on the surface of the agar plate to ensure comparable results.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestemmelse af Mikrobiel Extracellular enzymaktivitet i Vand, Jord og sediment ved hjælp af High Throughput Mikropladekrav Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Måling Flusmidler af mineralske Næringsstoffer og giftstoffer i Planter med radioaktive sporstoffer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Måling Carbon-baserede Kontaminant Mineralisering Brug Kombineret CO<sub&gt; 2</sub&gt; Flux og Kulstofdateringer Analyser

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måling og kortlægning mønstre af jorderosion og Deposition relateret til jordbunden karbonat koncentrationer Under landbrugsdrift

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

Effekten af anvendelsen af timian æteriske olie på mikrobielle belastning under kød tørring

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Dobbelt-strenget RNA Oral leveringsmetoder til at fremkalde RNA-interferens i Phloem og plante-sap-fodring Hemipteran insekter

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Measuring Stolons and Rhizomes of Turfgrasses Using a Digital Image Analysis System

Måling af Stolons og jordstængler af Turfgrasses ved hjælp af en Digital Image analysesystem

Length and diameter of stolons or rhizomes are usually measured using simple rulers and calipers. This procedure is slow and laborious, so it is often ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

En løkke-medieret isotermisk forstærkning (lampe) Assay til hurtig identifikation af Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

Aftagne blad analyser for at forenkle genekspression undersøgelser i kartoffel under infestation ved at tygge insekt Manduca Sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Xylem vand distribution i woody planter visualiseret med en Cryo-scanning elektronmikroskop

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...