Name: measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products
Uploaded: 2020-12-05T14:00:00
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Siamo molto grati a Frank Yates per il suo prezioso consiglio. Questo lavoro è stato sostenuto da Sup'Biotech.

1. Preparazione dell'inocula
<ol><li>Prima dell'esperimento, posare 5 μL di Trichoderma spp. Le spore SBT10-2018 conservate a 4 °C su mezzo agar destrosio di patate (PDA) e incubano per 4 giorni a 30°C con esposizione regolare alla luce per favorire la formazione di conidia42 (Figura 1,pannello A). NOTA: Trichoderma spp. SBT10-2018 è stato isolato dal legno ed è utilizzato come modello in questo studio per la sua rapida crescita e facilità...

L'approccio qui presentato consente la valutazione delle proprietà antifungine dei prodotti di origine vegetale minimamente lavorati. In questo protocollo, la distribuzione omogenea delle spore sulla superficie dell'agar si ottiene utilizzando perline di vetro da 2 mm. Questo passaggio richiede capacità di movimentazione per distribuire correttamente le perline e ottenere risultati riproducibili, consentendo in ultima analisi il confronto di effetti antifungini in diverse fasi della crescita fungina. Abbiamo scoperto c...

Le perdite globali di frutta e verdura possono raggiungere fino al 50% dellaproduzione 1 e derivare principalmente dal decadimento alimentare causato dal deterioramento dei funghi sul campo o durante lo stoccaggio post-raccolta2,3,nonostante l'ampia occupazione di fungicidi sintetici dalla metà del XX secolo4. L'uso di queste sostanze viene riconsiderato in quanto rappresenta gravi rischi per l'ambiente e la salute. Poiché le conseguenze dannose del loro uso si stanno mostrando in tutti gli ecosistemi e le prove di potenziali impatti sulla salute sisono accumulate 5,6, si stanno sviluppando nuove alternative alle vecchie strategie profilattiche per i trattamenti pre e post-raccolta7,8,9. Quindi la sfida che dobbiamo affrontare è duplice. Le nuove strategie fungicide devono, in primo luogo, mantenere i livelli di efficacia della protezione alimentare contro i fitopatogeni e, in secondo luogo, contribuire in secondo luogo a ridurre drasticamente l'impronta ambientale delle pratiche agricole. Per raggiungere questo ambizioso obiettivo, vengono proposte strategie ispirate alle difese naturali evolute nelle piante poiché sono state evidenziate più di 1000 specie di piante per le loro proprietà antimicrobiche8. Ad esempio, le piante che hanno sviluppato fungicidi naturali per combattere i fitopatogeni sono una nuova risorsa per esplorare lo sviluppo di nuovi prodotti di biocontrollo2. Gli oli essenziali sono molecole di punta di questo tipo. Ad esempio, l'olio essenziale di Origanum protegge le piante di pomodoro dalla muffa grigia nelle serre 10 e gli oli essenziali Solidago canadensis L. e cassia hanno dimostrato di preservare le fragole post-raccolte dai danni della muffagrigia 11,12. Questi esempi dimostrano che il biocontrollo e in particolare i prodotti di origine vegetale rappresentano una soluzione che combina efficacia biologica e sostenibilità ambientale.
Pertanto, le piante sono un'importante risorsa di molecole di potenziale interesse per l'industria della protezione delle colture. Tuttavia, solo una manciata di prodotti vegetali è stata proposta per essere utilizzata come prodotti di biocontrollo, anche se sono generalmente riconosciuti come sicuri, non fitotossici edeco-compatibili 2. Sono state osservate alcune difficoltà nella trasposizione dal laboratorio al campo, come l'efficacia che diminuisce una volta applicata in vivo2,9. Pertanto, diventa importante migliorare la capacità dei test di laboratorio di prevedere meglio l'efficacia sul campo. In questo contesto, i metodi di prova antimicotici per i prodotti di origine vegetale sono necessari sia per valutarne l'efficacia antimicotico sia per definire le loro condizioni ottimali per l'uso. In particolare, i prodotti di biocontrollo sono generalmente meno efficienti dei fungicidi chimici, quindi una migliore comprensione del loro modo di agire è importante per proporre formulazioni adeguate, identificare le modalità di applicazione nei campi e definire quale stadio di sviluppo dell'agente patogeno è vulnerabile al bioproduttore candidato.
Gli attuali approcci che affrontano le attività antibatteriche e antifungine includono metodi di diffusione come la diffusione del disco di agar, la diluizione, la bioautografia e la citometria del flusso13. La maggior parte di queste tecniche, e più specificamente, i test standard di suscettibilità antifungina - test di diffusione e diluizione agar-disk - sono ben adattati per valutare l'attività antimicrobica dei composti solubili sulle spore batteriche e fungine nelle sospensioni liquide14. Tuttavia, questi metodi non sono generalmente adatti per testare composti solidi come la polvere vegetale essiccata o per quantificare l'attività antifungina durante la crescita del micelio in quanto richiedono la diluizione delle spore o la diffusione di spore su piastre di agar e / o diluizione di composti antifungini13. Nel metodo avvelenato dal cibo, le piastre di agar contenenti l'agente antimicotico vengono inoculate con un disco di 5-7 mm di diametro campionato da una coltura di funghi vecchia di 7 giorni senza considerare la quantità precisa di micelio iniziale. Dopo l'incubazione, l'attività antimicotica è determinata come percentuale di inibizione della crescita radiale17,18,19. Con questo approccio possiamo valutare l'attività antimicotica sulla crescita miceliale. Al contrario, il metodo di diluizione dell'agar viene eseguito per determinare l'attività antimicotica sulle spore direttamente inoculate sulla superficie della piastra di agar contenente i composti antifungini13,20,21. Questi due approcci danno risultati complementari sull'attività antimicotica. Tuttavia queste sono due tecniche indipendenti utilizzate in parallelo che non forniscono un confronto accurato fianco a fianco dell'efficacia relativa dei composti antifungini su spore e micelio17,20,22 poiché la quantità di materiale fungino iniziale differisce nei due approcci. Inoltre, l'attività antimicotica di un prodotto di origine vegetale è spesso il risultato della combinazione di molecole antifungine sintetizzati dalle piante per affrontare agenti patogeni. Queste molecole comprendono proteine, peptidi23,24, e metaboliti con un'ampia diversità chimica e appartenenti a diverse classi di molecole come polifenoli, terpeni, alcaloidi25, glucosinolati8, e composti organosolfuri26. Alcune di queste molecole sono volatili o diventano volatili durante l'attacco patogeno27. Questi agenti sono spesso scarsamente solubili in acqua e composti ad alta pressione di vapore che devono essere recuperati attraverso la distillazione dell'acqua come oli essenziali, alcune delle cui attività antimicrobiche sono state ben consolidate28. Sono stati sviluppati saggi di suscettibilità mediati in fase di vapore per misurare l'attività antimicrobica dei composti volatili dopo l'evaporazione e la migrazione attraverso la fase di vapore29. Questi metodi si basano sull'introduzione di composti antifungini a distanza dalla coltura microbica29,30,31,32,33. Nel saggio di agar in fase di vapore comunemente usato, gli oli essenziali vengono depositati su un disco di carta e posizionati al centro della copertura della piastra di Petri a distanza dalla sospensione batterica o fungina della spora, che viene diffusa su un mezzo agar. Il diametro della zona di inibizione della crescita viene quindi misurato allo stesso modo del metodo di diffusione agar-disco20,24. Altri approcci sono stati sviluppati per fornire una misurazione quantitativa della suscettibilità antifungina in fase di vapore degli oli essenziali, derivata dal metodo di diluizione del brodo da cui è stata calcolata un'attività antimicrobica mediata in fase di vapore inibitoria32, o derivati da saggi di diffusione agar-disk31. Questi metodi sono generalmente specifici per gli studi di attività in fase di vapore e non appropriati ai saggi di inibizione del contatto. Ciò impedisce la determinazione del contributo relativo degli agenti volatili e non volatili all'attività antimicotica di una miscela bioattiva complessa.
Il metodo quantitativo che abbiamo sviluppato mira a misurare l'effetto antimicotico della polvere vegetale essiccata su quantità controllate di spore e micelio coltivato depositato sulla superficie di un mezzo agar per riprodurre la crescita aerea dei fitopatogeni durante l'infezionedelle piante 15 e una rete miceliale interconnessa16. L'approccio è una configurazione sperimentale modificata basata sui metodi di diluizione dell'agar e avvelenati dagli alimenti che consente anche, nella stessa configurazione sperimentale, la quantificazione affiancata del contributo di metaboliti antifungini volatili e non volatili. In questo studio, il metodo è stato confrontato con l'attività di tre preparati antifungini ben caratterizzati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave-vacuclav 24B+</td>
			<td>Melag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbendazim</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>378674-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>547254</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five millimeters diameter stainless steel tube</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food dehydrator</td>
			<td>Sancusto</td>
			<td></td>
			<td>six trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic powder</td>
			<td>Organic shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>CLOUP</td>
			<td>65020</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer counting cell</td>
			<td>Jeulin</td>
			<td>713442</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&#160;UM400</td>
			<td>30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife mill</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>TSM6A013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>HCNT-001-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring ruler</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinets</td>
			<td>FASTER</td>
			<td></td>
			<td>FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014407</td>
			<td>100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014411</td>
			<td>20 - 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014412</td>
			<td>2 - 20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1194500</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1473&#160;</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controllers-EASY 60</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>EASY-P60-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>70139-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale-RADWAG</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>B126698</td>
			<td>AS220.R2-ML 220g/0.1mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rake</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86-1569001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse microscope AE31E trinocular</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>M097917</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile graduated pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>1254001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymus essential oil</td>
			<td>Drugstore</td>
			<td></td>
			<td>Essential oil 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.762010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth pick</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichoderma spp strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strain of LRPIA laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>FORS-001-002</td>
			<td>/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products

Il protocollo descritto si basa su una tecnica di trasferimento della spina che consente una determinazione accurata delle quantità di microrganismi e delle loro fasi di sviluppo. Un numero specificato di spore viene distribuito su una piastra di agar. Questa piastra di agar viene incubata per un periodo definito per consentire ai funghi di raggiungere lo stadio di sviluppo previsto, ad eccezione delle spore in cui non è richiesta l'incubazione. Le spine di agar coperte da spore, ife o micelio vengono successivamente ritirate e trasferite su supporti di agar contenenti il composto antimicotico da testare sia posizionate a distanza dai funghi che a contatto. Questo metodo è applicabile per testare sia estratti liquidi che campioni solidi (polveri). È particolarmente adatto per quantificare i contributi relativi degli agenti volatili e non volatili nelle miscele bioattive e per determinarne gli effetti, in particolare sulle spore, sull'iphae precoce e sul micelio.
Il metodo è molto rilevante per la caratterizzazione dell'attività antimicotica dei prodotti di biocontrollo, in particolare dei prodotti di origine vegetale. Infatti, per il trattamento dell'impianto, i risultati possono essere utilizzati per guidare la scelta delle modalità di applicazione e stabilire le soglie di innesco.

Per valutare la capacità del metodo quantitativo di discriminare le modalità di azione di diversi tipi di composti antifungini, abbiamo confrontato l'efficacia di tre noti agenti antifungini. Carbendazim è un fungicida sintetico non volatile che è stato ampiamente utilizzato per controllare una vasta gamma di malattie fungine nellepiante 39,40. L'olio essenziale di thymus vulgaris è stato in gran parte descritto per la sua attività antibatterica e ...

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Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Descriviamo un metodo modificato a base di agar progettato per quantificare gli effetti antifungini dei prodotti di origine vegetale. Sia i contributi volatili che i contributi non volatili all'attività antimicotica possono essere valutati attraverso questo protocollo. Inoltre, l'efficacia contro i funghi può essere misurata in fasi chiave di sviluppo in un'unica configurazione sperimentale.

Misurazione dell'attività antifungina volatile e non volatile dei prodotti biocontrollo

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

This protocol provides a method for making accurate side-by-side comparisons of the relative efficacy of volatile and non-volatile antifungal compounds at different fungal growth stages. This method is well-suited for evaluating the antifungal activity of plant-derived products used in dried or liquid forms that contain a wide diversity of molecules. This method can provide valuable information about the mode of application of plant-derived products and is particularly well-suited in the field of biocontrol.Demonstrating the procedure will be Valentina Gligorijevic, an engineer assistant from the Sup'Biotech laboratory. For conidia collection, layer three milliliters of 0.05%Tween 20 on a trichoderma mycelium culture and use a rake to release the conidia from the conidiophores taking care not to press down on the mycelium to prevent the hyphae from being torn away. When all of the conidia have been released, use a micropipette to quickly recover and add the conidia solution to a 15 milliliter tube for counting.To prepare fungal plates, deposit 100 microliters of spores at a three times 10 to the six spores per milliliter concentration onto a nine centimeter Petri dish containing PDA medium, and use a sterile spatula to add 10 grams of two millimeter diameter glass beads to the plate. Then gently shake the plate forward and backward and spin and rotate the plate in 90 degree segments until it has been fully rotated to evenly distribute the spores across the surface of the agar. Then incubate the plate at 30 degrees Celsius until growth inhibition analysis.To perform a contact-inhibition assay with garlic powder, use a sterile spatula to weigh the desired garlic powder quantity into individual 50 milliliter tubes. to obtain concentrations generally ranging from 0.25 to 16 milligrams per milliliter. Add 10 milliliters of approximately 45 degrees Celsius PDA to each tube and carefully invert each tube several times to evenly distribute the powder throughout the agar.Quickly, pour the homogenized suspensions into five centimeter diameter Petri dishes and allow the agar to solidify at room temperature. To perform a contact-inhibition assay, use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the agar in the control and antifungal compound-treated dishes, and use a sterile toothpick to dispose of the agar cylinders. Next, use a new five millimeter diameter stainless steel tube to plot 15 to 20 circles randomly into the fungal plates, and use sterile toothpicks to carefully transfer the spore, hyphae, or mycelium-covered cylinders into the empty regions of the PDA plates.Then return the plates to the 30 degree Celsius incubator. To prepare a plates for a vapor-phase antifungal inhibition assay, pour 10 milliliters of PDA medium into the lid of a five centimeter diameter Petri dish containing 10 milliliters of PDA medium containing antifungal compounds or PDA medium alone, and allow the agar to solidify at room temperature. Using a 50 milliliter centrifical tube as a calibration tool, make a circle of PDA in the center of the agar and use a sterile spatula to remove the agar around the circle.Use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the medium in the lid and use a sterile toothpick to discard the auger cylinder. Then use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to randomly make plugs in the prepared fungal plates, and use a sterile toothpick to carefully transfer spore, hyphae, or mycelium-coated plugs into the lids of the assay plates. In this analysis, trichoderma species SBT 10-2018 growth inhibition triggered by three antifungal compounds was evaluated using contact and vapor-phase inhibition assays as demonstrated for each fungal stage.A higher spore sensitivity to carbendazim was observed compared to early hyphae and mycelium networks when trichoderma and antifungal compounds were in contact. In contrast, carbendozim had no antifungal effect on trichoderma when the fungus was placed at a distance from the fungicide in accordance with the low volatility of this substance. When thymus vulgaris essential oil was used as an antifungal compound, a higher sensitivity was observed for spores and early hyphae as compared to mycelium growth inhibition at 0.025%essential oil.As expected, thymus vulgaris essential oil presented identical antifungal activity irrespective of the distance between the fungus and the oil. When garlic powder was used, a higher efficacy was observed against spore germination and early hyphae elongation than for mycellium growth. Particular attention must be paid during the fungal plate preparation to make sure that the spores are evenly distributed on the surface of the agar plate to ensure comparable results.

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