Name: measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products
Uploaded: 2020-12-05T14:00:00
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フランク・イェーツの貴重なアドバイスにとても感謝しています。この作品はSup'Biotechによって支えられていました。

1. インノクラ製剤
<ol><li>実験の前に、 トリコデルマspp の5μLを置く。SBT10-2018胞子は、4°Cで保存されたジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)で、コニディア形成42 を促進するために定期的な光暴露で30°Cで4日間インキュベートする(図1、パネルA)。 注: トリコデルマspp.SBT10-2018は木材から隔離されており、急速な成長と胞子回収の容易?...

ここで提示されるアプローチは、最小限に処理された植物由来の製品の抗真菌特性の評価を可能にする。このプロトコルでは、寒天表面上の胞子の均質な分布は、2mmガラスビーズを使用して達成される。このステップでは、ビーズを適切に配布し、再現性のある結果を得るためのハンドリングスキルが必要であり、最終的には真菌の成長の異なる段階で抗真菌効果の比較を可能にします。5mm?...

果物や野菜の世界的な損失は、生産1の最大50%に達することができ、20世紀半ばから合成殺菌剤の広範な雇用にもかかわらず、主に畑や収穫後の貯蔵中に生じた食の腐敗から生じる2、3。これらの物質の使用は、深刻な環境および健康上の危険を表すため、再考されています。その使用の有害な結果が生態系全体に現れ、潜在的な健康への影響の証拠が5、6を蓄積したので、収穫前および収穫後の治療7、8、9のための古い予防戦略に代わる新しい選択肢が開発されている。したがって、私たちが直面する課題は2倍です。新しい殺菌戦略は、まず、植物病原体に対する食物保護の有効性のレベルを維持し、それに付随して、農業慣行の環境フットプリントを劇的に削減することに貢献しなければならない。この野心的な目標を達成するために、植物で進化した自然防御に触発された戦略は、その抗菌特性8のために1000種以上の植物種が強調されているように提案されています。例えば、植物病原体と戦うために天然の殺菌剤を開発した植物は、新しいバイオコントロール製品の開発を探求する新しい資源である2.エッセンシャルオイルはこのタイプの旗艦分子です。例えば、オリガナム精油は、トマト植物を温室10およびSolidagoカナデンシスL.およびカシアエッセンシャルオイルの灰色のカビ損傷11,12から収穫後のイチゴを保存することが示されている。これらの例は、バイオコントロールおよび特に植物由来の製品が生物学的有効性と環境持続可能性を組み合わせた溶液を表していることを示している。
したがって、植物は作物保護産業にとって潜在的な関心の分子の重要な資源である。しかし、一般的に安全で非植物性で環境に優しいと認識されているにもかかわらず、バイオコントロール製品として使用される植物製品はほんの一握りです。ラボから現場への移調の難点が見られ、一度インビボ2,9に適用されると効力が低下するなどがある。したがって、現場の有効性をより良く予測するために、ラボテストの能力を向上させることが重要になります。この文脈では、植物由来の製品の抗真菌試験方法は、その抗真菌効果を評価し、使用するための最適な条件を定義するために必要です。具体的には、バイオコントロール製品は一般的に化学殺菌剤よりも効率が悪いので、適切な製剤を提案し、フィールドでの適用様式を特定し、病原体のどの発達段階がバイオ製品候補に対して脆弱かを定義するために、それらの作用様式をよりよく理解することが重要です。
抗菌活動や抗真菌活動に取り組む現在のアプローチには、寒天ディスク拡散、希釈、バイオサイン、フローサイトメトリーなどの拡散法が含まれる13.これらの技術のほとんど、より具体的には、標準的な抗真菌感受性試験(寒天ディスク拡散および希釈アッセイ)は、液体懸濁液中の細菌および真菌胞子に対する可溶性化合物の抗菌活性を評価するために十分に適応されている14.しかし、これらの方法は、一般的に乾燥植物粉末などの固体化合物を試験したり、寒天プレートに広がる胞子希釈または胞子を必要とするため、菌糸体の成長中に抗真菌活性を定量化するには適していません。13.食品中毒法では、抗真菌剤を含む寒天プレートを、7日間の古い真菌培養物から採取した直径5~7mmのディスクを、正確な菌糸体の量を考慮せずに接種する。インキュベーション後、抗真菌活性は放射状増殖阻害の割合として決定される17,18,19.このアプローチにより、菌体成長に対する抗真菌活性を評価することができます。対照的に、寒天希釈法は、抗真菌化合物を含む寒天プレートの表面に直接接種された胞子に対する抗真菌活性を決定するために行われる13,20,21.これら2つのアプローチは、抗真菌活性に対する相補的な結果を与える。しかし、これらは、胞子と菌糸体上の抗真菌化合物の相対的な有効性の正確な並べて比較を提供しない並列で使用される2つの独立した技術です17,20,22 開始真菌材料の量は、2つのアプローチで異なります。さらに、植物由来の産物の抗真菌活性は、しばしば、植物によって合成された抗真菌分子の組み合わせから生じる病原体に直面する。これらの分子は、タンパク質、ペプチドを包含する23,24、および広範な化学的多様性を有し、ポリフェノール、テルペン、アルカロイドなどの分子の異なるクラスに属する代謝産物25、グルコシノレート8、および有機硫黄化合物26.これらの分子の一部は、病原体の攻撃中に揮発性または揮発性になる27.これらの薬剤は、ほとんどの場合、精油として水蒸留を通じて回収しなければならない水溶性および高気圧化合物であり、その抗菌活性が十分に確立されている28.気相媒介感受性アッセイは、蒸発後の揮発性化合物の抗菌活性を測定し、蒸気相を介して移動する29.これらの方法は、微生物培養物から離れた抗真菌化合物の導入に基づく29,30,31,32,33.一般的に使用される気相寒天アッセイでは、エッセンシャルオイルを紙ディスクに堆積させ、寒天培地に広がる細菌または真菌胞体懸濁液から遠く離れたペトリ皿のカバーの中央に置かれます。成長阻害のゾーンの直径は、寒天ディスク拡散法と同じ方法で測定されます。20,24.その他のアプローチは、阻害された気相媒介性抗菌活性を計算したブロス希釈法に由来する精油の気相抗真菌感受性の定量的測定を提供するために開発された32、または寒天ディスク拡散アッセイに由来する31.これらの方法は、一般に気相活性研究に特異的であり、接触阻害アッセイには適さない。これは、複雑な生理活性混合物の抗真菌活性に対する揮発性および不揮発性物質の相対的な寄与の決定を妨げる。
我々が開発した定量法は、乾燥植物粉末が乾燥した植物粉末の制御量の胞子及び成長した菌糸体を寒天培地の表面に付着させ、植物15 の感染時の植物病原体の空中成長ならびに相互接続された菌網16に及ぼす抗真菌効果を測定することを目的とする。このアプローチは、寒天希釈法と食品毒法に基づく改変実験セットアップであり、同じ実験セットアップにおいて、揮発性および不揮発性抗真菌性代謝産物の寄与を並べて定量化することもできる。本研究では、この方法は、3つの十分に特徴付けられる抗真菌製剤の活性に対してベンチマークされている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave-vacuclav 24B+</td>
			<td>Melag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbendazim</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>378674-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>547254</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five millimeters diameter stainless steel tube</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food dehydrator</td>
			<td>Sancusto</td>
			<td></td>
			<td>six trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic powder</td>
			<td>Organic shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>CLOUP</td>
			<td>65020</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer counting cell</td>
			<td>Jeulin</td>
			<td>713442</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&#160;UM400</td>
			<td>30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife mill</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>TSM6A013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>HCNT-001-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring ruler</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinets</td>
			<td>FASTER</td>
			<td></td>
			<td>FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014407</td>
			<td>100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014411</td>
			<td>20 - 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014412</td>
			<td>2 - 20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1194500</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1473&#160;</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controllers-EASY 60</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>EASY-P60-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>70139-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale-RADWAG</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>B126698</td>
			<td>AS220.R2-ML 220g/0.1mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rake</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86-1569001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse microscope AE31E trinocular</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>M097917</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile graduated pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>1254001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymus essential oil</td>
			<td>Drugstore</td>
			<td></td>
			<td>Essential oil 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.762010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth pick</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichoderma spp strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strain of LRPIA laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>FORS-001-002</td>
			<td>/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products

記載されたプロトコルは、微生物の量とその発生段階を正確に決定できるプラグ転送技術に基づいています。指定された数の胞子が寒天プレートに広がる。この寒天プレートは、培養が必要ない胞子を除いて、真菌が期待される発達段階に到達できるように、定義された期間インキュベートされる。胞子、ヒファ、または菌糸体で覆われた寒天プラグは、次に取り出され、試験対象の抗真菌化合物を含む寒天培地に移管され、真菌から離れた場所または接触した状態で配置されます。この方法は、液体抽出物と固体サンプル(粉末)の両方を試験するのに適用可能です。特に、生理活性混合物中の揮発性物質と不揮発性物質の相対的な寄与を定量化し、特に胞子、初期のヒファ、および菌糸体に対するその効果を決定するために適しています。
この方法は、バイオコントロール製品、特に植物由来製品の抗真菌活性の特性評価に非常に関連しています。実際に、植物の処理のために、結果は、アプリケーションのモードの選択を導き、トリガーのしきい値を確立するために使用することができます。

異なるタイプの抗真菌化合物の作用様式を判別する定量的方法の能力を評価するために、3つの有名な抗真菌剤の有効性を比較した。カルベンダジンは、植物39、40の真菌疾患の広い範囲を制御するために広く使用されている不揮発性の合成殺菌剤である。胸腺下品精油は、主にその抗菌および抗真菌活性について記載されており、天然食品保...

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Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

植物由来製品の抗真菌効果を定量化するために設計された修飾寒天ベースの方法について述べています。このプロトコルを通じて、抗真菌活性に対する揮発性および不揮発性の寄与の両方を評価することができる。さらに、真菌に対する有効性は、単一の実験セットアップの主要な発達段階で測定することができる。

バイオコントロール製品の揮発性および不揮発性抗真菌活性の測定

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

This protocol provides a method for making accurate side-by-side comparisons of the relative efficacy of volatile and non-volatile antifungal compounds at different fungal growth stages. This method is well-suited for evaluating the antifungal activity of plant-derived products used in dried or liquid forms that contain a wide diversity of molecules. This method can provide valuable information about the mode of application of plant-derived products and is particularly well-suited in the field of biocontrol.Demonstrating the procedure will be Valentina Gligorijevic, an engineer assistant from the Sup'Biotech laboratory. For conidia collection, layer three milliliters of 0.05%Tween 20 on a trichoderma mycelium culture and use a rake to release the conidia from the conidiophores taking care not to press down on the mycelium to prevent the hyphae from being torn away. When all of the conidia have been released, use a micropipette to quickly recover and add the conidia solution to a 15 milliliter tube for counting.To prepare fungal plates, deposit 100 microliters of spores at a three times 10 to the six spores per milliliter concentration onto a nine centimeter Petri dish containing PDA medium, and use a sterile spatula to add 10 grams of two millimeter diameter glass beads to the plate. Then gently shake the plate forward and backward and spin and rotate the plate in 90 degree segments until it has been fully rotated to evenly distribute the spores across the surface of the agar. Then incubate the plate at 30 degrees Celsius until growth inhibition analysis.To perform a contact-inhibition assay with garlic powder, use a sterile spatula to weigh the desired garlic powder quantity into individual 50 milliliter tubes. to obtain concentrations generally ranging from 0.25 to 16 milligrams per milliliter. Add 10 milliliters of approximately 45 degrees Celsius PDA to each tube and carefully invert each tube several times to evenly distribute the powder throughout the agar.Quickly, pour the homogenized suspensions into five centimeter diameter Petri dishes and allow the agar to solidify at room temperature. To perform a contact-inhibition assay, use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the agar in the control and antifungal compound-treated dishes, and use a sterile toothpick to dispose of the agar cylinders. Next, use a new five millimeter diameter stainless steel tube to plot 15 to 20 circles randomly into the fungal plates, and use sterile toothpicks to carefully transfer the spore, hyphae, or mycelium-covered cylinders into the empty regions of the PDA plates.Then return the plates to the 30 degree Celsius incubator. To prepare a plates for a vapor-phase antifungal inhibition assay, pour 10 milliliters of PDA medium into the lid of a five centimeter diameter Petri dish containing 10 milliliters of PDA medium containing antifungal compounds or PDA medium alone, and allow the agar to solidify at room temperature. Using a 50 milliliter centrifical tube as a calibration tool, make a circle of PDA in the center of the agar and use a sterile spatula to remove the agar around the circle.Use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the medium in the lid and use a sterile toothpick to discard the auger cylinder. Then use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to randomly make plugs in the prepared fungal plates, and use a sterile toothpick to carefully transfer spore, hyphae, or mycelium-coated plugs into the lids of the assay plates. In this analysis, trichoderma species SBT 10-2018 growth inhibition triggered by three antifungal compounds was evaluated using contact and vapor-phase inhibition assays as demonstrated for each fungal stage.A higher spore sensitivity to carbendazim was observed compared to early hyphae and mycelium networks when trichoderma and antifungal compounds were in contact. In contrast, carbendozim had no antifungal effect on trichoderma when the fungus was placed at a distance from the fungicide in accordance with the low volatility of this substance. When thymus vulgaris essential oil was used as an antifungal compound, a higher sensitivity was observed for spores and early hyphae as compared to mycelium growth inhibition at 0.025%essential oil.As expected, thymus vulgaris essential oil presented identical antifungal activity irrespective of the distance between the fungus and the oil. When garlic powder was used, a higher efficacy was observed against spore germination and early hyphae elongation than for mycellium growth. Particular attention must be paid during the fungal plate preparation to make sure that the spores are evenly distributed on the surface of the agar plate to ensure comparable results.

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