Name: measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products
Uploaded: 2020-12-05T14:00:00
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Somos muito gratos a Frank Yates por seu precioso conselho. Este trabalho foi apoiado pela Sup'Biotech.

1. Preparação de inócula
<ol><li>Antes do experimento, estava 5 μL de Trichoderma spp. Os esporos SBT10-2018 armazenados a 4 °C no natural de ágar médio (PDA) e incubam por 4 dias a 30°C com exposição regular à luz para promover a formação conidia42 (Figura 1, painel A). NOTA: Trichoderma spp. O SBT10-2018 foi isolado da madeira e é usado como modelo neste estudo para seu rápido crescimento e facilidade de recuperação de esporos...

A abordagem aqui apresentada permite a avaliação de propriedades antifúngicas de produtos minimamente processados derivados de plantas. Neste protocolo, a distribuição homogênea dos esporos na superfície do ágar é alcançada utilizando contas de vidro de 2 mm. Esta etapa requer habilidades de manuseio para distribuir corretamente as contas e obter resultados reprodutíveis, permitindo, em última análise, a comparação de efeitos antifúngicos em diferentes estágios de crescimento fúngico. Descobrimos que co...

As perdas globais de frutas e hortaliças podem atingir até 50% da produção1 e resultar principalmente da decadência alimentar causada pela deterioração de fungos no campo ou durante o armazenamento pós-colheita2,3, apesar do amplo emprego de fungicidas sintéticas desde meados do séculoXX 4. O uso dessas substâncias está sendo reconsiderado, pois representa sérios riscos ambientais e à saúde. Como as consequências nocivas de seu uso estão aparecendo em todos os ecossistemas e evidências de potenciais impactos à saúde acumularam5,6, novas alternativas às velhas estratégias profiláticas estão sendo desenvolvidas para tratamentos pré e pós-colheita7,8,9. Por isso, o desafio que enfrentamos é duplo. Novas estratégias fungicidas devem, em primeiro lugar, manter os níveis de eficácia da proteção alimentar contra fitopatógenos e, em segundo lugar, contribuir para reduzir drasticamente a pegada ambiental das práticas agrícolas. Para cumprir esse objetivo ambicioso, estratégias inspiradas nas defesas naturais evoluídas nas plantas estão sendo propostas, pois mais de 1000 espécies de plantas foram destacadas por suas propriedades antimicrobianas8. Por exemplo, plantas que desenvolveram fungicidas naturais para combater fitopatógenos são um novo recurso na exploração do desenvolvimento de novos produtos de biocontrole2. Óleos essenciais são moléculas emblemáticas desse tipo. Por exemplo, o óleo essencial origanum protege as plantas de tomate contra o molde cinza nas estufas 10 e solidago canadensis L. e óleos essenciais cássia têm sido mostrados para preservar morangos pós-colhidos de danos de moldes cinzentos11,12. Esses exemplos ilustram que o biocontrole e, notadamente, os produtos derivados das plantas representam uma solução que combina eficácia biológica e sustentabilidade ambiental.
Assim, as plantas são um importante recurso de moléculas de potencial interesse para a indústria de proteção de culturas. No entanto, apenas um punhado de produtos vegetais foram propostos para serem usados como produtos de biocontrole, embora sejam geralmente reconhecidos como seguros, não fitóxicos e ecológicos2. Algumas dificuldades na transposição do laboratório para o campo têm sido observadas, como a eficácia diminuindo uma vez aplicada in vivo2,9. Assim, torna-se importante melhorar a capacidade dos testes de laboratório para melhor prever a eficácia do campo. Neste contexto, métodos de teste antifúngicos para produtos derivados de plantas são necessários tanto para avaliar sua eficácia antifúngica quanto para definir suas condições ideais de uso. Especificamente, os produtos de biocontrole são geralmente menos eficientes do que fungicidas químicos, por isso uma melhor compreensão de seu modo de ação é importante para propor formulações adequadas, identificar o modo de aplicação nos campos e definir qual estágio de desenvolvimento do patógeno é vulnerável ao bioproduto candidato.
As abordagens atuais que abordam atividades antibacterianas e antifúngicas incluem métodos de difusão, como difusão de disco de ágar, diluição, bioautografia e citometria de fluxo13. A maioria dessas técnicas, e mais especificamente, os testes padrão de suscetibilidade antifúngicos - ensaios de difusão e diluição de ágar-disco - são bem adaptados para avaliar a atividade antimicrobiana de compostos solúveis em esporos bacterianos e fúngicos em suspensões líquidas14. No entanto, esses métodos geralmente não são adequados para testar compostos sólidos, como pó vegetal seco ou para quantificar a atividade antifúngica durante o crescimento do micélio, pois requerem diluição de esporos ou esporos espalhados em placas de ágar e/ou diluição de compostos antifúngicos13. No método envenenado por alimentos, as placas de ágar contendo o agente antifúngico são inoculadas com um disco de 5-7 mm de diâmetro amostrado de uma cultura de fungos de 7 dias de idade sem considerar a quantidade precisa de micélio inicial. Após a incubação, a atividade antifúngica é determinada como um por cento da inibição do crescimento radial17,18,19. Com essa abordagem podemos avaliar a atividade antifúngica no crescimento micelial. Em contraste, o método de diluição de ágar é realizado para determinar a atividade antifúngica em esporos diretamente inoculados na superfície da placa de ágar contendo os compostos antifúngicos13,20,21. Essas duas abordagens dão resultados complementares sobre a atividade antifúngica. No entanto, estas são duas técnicas independentes usadas em paralelo que não fornecem comparação lado a lado precisa da eficácia relativa dos compostos antifúngicos em esporos e micélio17,20,22 como a quantidade de material fúngico inicial difere nas duas abordagens. Além disso, a atividade antifúngica de um produto derivado de plantas muitas vezes resulta da combinação de moléculas antifúngicas sintetizadas pelas plantas para enfrentar patógenos. Essas moléculas abrangem proteínas, peptídeos23,24, e metabólitos com ampla diversidade química e pertencentes a diferentes classes de moléculas como polifenóis, terpenos, alcaloïds25, glucosinolas8, e compostos organosulfur26. Algumas dessas moléculas são voláteis ou se tornam voláteis durante o ataque de patógenos27. Esses agentes são, na maioria das vezes, compostos solúveis em água e alta pressão de vapor que devem ser recuperados através da destilação da água como óleos essenciais, alguns dos quais atividades antimicrobianas foram bem estabelecidas28. Ensaios de suscetibilidade mediados em fase de vapor foram desenvolvidos para medir a atividade antimicrobiana de compostos voláteis após a evaporação e migração através da fase de vapor29. Esses métodos baseiam-se na introdução de compostos antifúngicos à distância da cultura microbiana29,30,31,32,33. No ensaio ágar comumente usado em fase de vapor, óleos essenciais são depositados em um disco de papel e colocados no centro da tampa da placa de Petri à distância da suspensão de esporos bacterianos ou fúngicos, que é espalhada no meio ágar. O diâmetro da zona de inibição do crescimento é então medido da mesma forma que para o método de difusão do disco de ágar20,24. Outras abordagens foram desenvolvidas para fornecer a medição quantitativa da suscetibilidade antifúngica da fase vapor de óleos essenciais, derivadas do método de diluição do caldo do qual foi calculada uma atividade antimicrobiana mediada por vapor inibitório32, ou derivado de ensaios de difusão de ágar-disco31. Esses métodos são geralmente específicos para estudos de atividade em fase de vapor e não são apropriados para ensaios de inibição de contato. Isso exclui a determinação da contribuição relativa de agentes voláteis e não voláteis para a atividade antifúngica de uma complexa mistura bioativa.
O método quantitativo que desenvolvemos visa medir o efeito antifúngico do pó de plantas secas em quantidades controladas de esporos e micélio cultivado depositado na superfície de um meio de ágar para reproduzir o crescimento aéreo de fitopatógenos durante a infecção das plantas15, bem como uma rede mycelial interconectada16. A abordagem é uma configuração experimental modificada baseada nos métodos de diluição de ágar e alimentos envenenados que também permite, na mesma configuração experimental, quantificação lado a lado da contribuição de metabólitos antifúngicos voláteis e não voláteis. Neste estudo, o método foi avaliado em relação à atividade de três preparações antifúngicas bem caracterizadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave-vacuclav 24B+</td>
			<td>Melag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbendazim</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>378674-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>547254</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five millimeters diameter stainless steel tube</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food dehydrator</td>
			<td>Sancusto</td>
			<td></td>
			<td>six trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic powder</td>
			<td>Organic shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>CLOUP</td>
			<td>65020</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer counting cell</td>
			<td>Jeulin</td>
			<td>713442</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&#160;UM400</td>
			<td>30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife mill</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>TSM6A013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>HCNT-001-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring ruler</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinets</td>
			<td>FASTER</td>
			<td></td>
			<td>FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014407</td>
			<td>100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014411</td>
			<td>20 - 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014412</td>
			<td>2 - 20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1194500</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1473&#160;</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controllers-EASY 60</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>EASY-P60-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>70139-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale-RADWAG</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>B126698</td>
			<td>AS220.R2-ML 220g/0.1mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rake</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86-1569001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse microscope AE31E trinocular</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>M097917</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile graduated pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>1254001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymus essential oil</td>
			<td>Drugstore</td>
			<td></td>
			<td>Essential oil 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.762010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth pick</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichoderma spp strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strain of LRPIA laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>FORS-001-002</td>
			<td>/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products

O protocolo descrito baseia-se em uma técnica de transferência de plug-plug que permite a determinação precisa das quantidades de microrganismos e seus estágios de desenvolvimento. Um número especificado de esporos estão espalhados em uma placa de ágar. Esta placa de ágar é incubada por um período definido para permitir que os fungos atinjam o estágio de desenvolvimento esperado, exceto para esporos onde a incubação não é necessária. Os plugues ágar cobertos por esporos, hifas ou micélio são retirados e transferidos para a mídia ágar contendo o composto antifúngico a ser testado a uma distância dos fungos ou em contato. Este método é aplicável para testar tanto extratos líquidos quanto amostras sólidas (pós). É particularmente adequado para quantificar as contribuições relativas de agentes voláteis e não voláteis em misturas bioativas e para determinar seus efeitos, especificamente sobre esporos, higiais precoces e micélio.
O método é altamente relevante para a caracterização da atividade antifúngica de produtos de biocontrole, notadamente produtos derivados de plantas. De fato, para o tratamento da estação, os resultados podem ser usados para orientar a escolha do modo de aplicação e estabelecer os limiares de gatilho.

Para avaliar a capacidade do método quantitativo de discriminar o modo de ação de diferentes tipos de compostos antifúngicos, comparamos a eficácia de três agentes antifúngicos conhecidos. Carbendazim é um fungicida sintético não volátil que tem sido amplamente utilizado para controlar uma ampla gama de doenças fúngicas nas plantas39,40. O óleo essencial de timo vulgar foi descrito em grande parte por sua atividade antibacteriana e antifún...

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Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Descrevemos um método modificado à base de ágar projetado para quantificar os efeitos antifúngicos de produtos derivados de plantas. Tanto contribuições voláteis quanto não voláteis para a atividade antifúngica podem ser avaliadas através deste protocolo. Além disso, a eficácia contra fungos pode ser medida em estágios-chave de desenvolvimento em uma única configuração experimental.

Medindo atividade antifúngica volátil e não volátil de produtos de biocontrole

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

This protocol provides a method for making accurate side-by-side comparisons of the relative efficacy of volatile and non-volatile antifungal compounds at different fungal growth stages. This method is well-suited for evaluating the antifungal activity of plant-derived products used in dried or liquid forms that contain a wide diversity of molecules. This method can provide valuable information about the mode of application of plant-derived products and is particularly well-suited in the field of biocontrol.Demonstrating the procedure will be Valentina Gligorijevic, an engineer assistant from the Sup'Biotech laboratory. For conidia collection, layer three milliliters of 0.05%Tween 20 on a trichoderma mycelium culture and use a rake to release the conidia from the conidiophores taking care not to press down on the mycelium to prevent the hyphae from being torn away. When all of the conidia have been released, use a micropipette to quickly recover and add the conidia solution to a 15 milliliter tube for counting.To prepare fungal plates, deposit 100 microliters of spores at a three times 10 to the six spores per milliliter concentration onto a nine centimeter Petri dish containing PDA medium, and use a sterile spatula to add 10 grams of two millimeter diameter glass beads to the plate. Then gently shake the plate forward and backward and spin and rotate the plate in 90 degree segments until it has been fully rotated to evenly distribute the spores across the surface of the agar. Then incubate the plate at 30 degrees Celsius until growth inhibition analysis.To perform a contact-inhibition assay with garlic powder, use a sterile spatula to weigh the desired garlic powder quantity into individual 50 milliliter tubes. to obtain concentrations generally ranging from 0.25 to 16 milligrams per milliliter. Add 10 milliliters of approximately 45 degrees Celsius PDA to each tube and carefully invert each tube several times to evenly distribute the powder throughout the agar.Quickly, pour the homogenized suspensions into five centimeter diameter Petri dishes and allow the agar to solidify at room temperature. To perform a contact-inhibition assay, use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the agar in the control and antifungal compound-treated dishes, and use a sterile toothpick to dispose of the agar cylinders. Next, use a new five millimeter diameter stainless steel tube to plot 15 to 20 circles randomly into the fungal plates, and use sterile toothpicks to carefully transfer the spore, hyphae, or mycelium-covered cylinders into the empty regions of the PDA plates.Then return the plates to the 30 degree Celsius incubator. To prepare a plates for a vapor-phase antifungal inhibition assay, pour 10 milliliters of PDA medium into the lid of a five centimeter diameter Petri dish containing 10 milliliters of PDA medium containing antifungal compounds or PDA medium alone, and allow the agar to solidify at room temperature. Using a 50 milliliter centrifical tube as a calibration tool, make a circle of PDA in the center of the agar and use a sterile spatula to remove the agar around the circle.Use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the medium in the lid and use a sterile toothpick to discard the auger cylinder. Then use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to randomly make plugs in the prepared fungal plates, and use a sterile toothpick to carefully transfer spore, hyphae, or mycelium-coated plugs into the lids of the assay plates. In this analysis, trichoderma species SBT 10-2018 growth inhibition triggered by three antifungal compounds was evaluated using contact and vapor-phase inhibition assays as demonstrated for each fungal stage.A higher spore sensitivity to carbendazim was observed compared to early hyphae and mycelium networks when trichoderma and antifungal compounds were in contact. In contrast, carbendozim had no antifungal effect on trichoderma when the fungus was placed at a distance from the fungicide in accordance with the low volatility of this substance. When thymus vulgaris essential oil was used as an antifungal compound, a higher sensitivity was observed for spores and early hyphae as compared to mycelium growth inhibition at 0.025%essential oil.As expected, thymus vulgaris essential oil presented identical antifungal activity irrespective of the distance between the fungus and the oil. When garlic powder was used, a higher efficacy was observed against spore germination and early hyphae elongation than for mycellium growth. Particular attention must be paid during the fungal plate preparation to make sure that the spores are evenly distributed on the surface of the agar plate to ensure comparable results.

Research

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Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos

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