Name: measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products
Uploaded: 2020-12-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products at JoVE.com

Мы очень благодарны Фрэнку Эйтсу за его драгоценный совет. Эта работа была поддержана Sup'Biotech.

1. Подготовка инойкулы
<ol><li>До эксперимента, лежал 5 йл Триходерма spp. Споры SBT10-2018 хранятся при 4 градусах Цельсия на картофеле декстроза агар среды (PDA) и инкубировать в течение 4 дней при 30 градусов по Цельсию с регулярным воздействием света для содействия образованию конидии<sup class="x...

Представленный здесь подход позволяет можно можно можно можно было бы можно можно было можно было можно можно было бы можно было можно можно было бы можно было можно получить для оценки противогрибковых свойств минимально обработанных растительных продуктов. В этом протоколе однород?...

Глобальные потери фруктов и овощей могут достигать до 50%производства 1 и в основном в результате распада продуктов питания, вызванного порчу грибов в поле или во времяпослеуборочного хранения 2,3, несмотря на обширную занятость синтетических фунгицидов ссередины двадцатого века 4. В настоящее время пересматривается вопрос об использовании этих веществ, поскольку оно представляет собой серьезную опасность для окружающей среды и здоровья. Как вредные последствия их использования появляются во всех экосистемах и доказательства потенциального воздействия на здоровьенакопилось 5,6, новые альтернативы старой профилактической стратегии разрабатываются для до- и после сбора урожаялечения 7,8,9. Поэтому задача, с которой мы сталкиваемся, дыдная. Новые фунгицидные стратегии должны, во-первых, поддерживать уровень эффективности продовольственной защиты от фитопатогенов и, соответственно, способствовать значительному снижению воздействия сельскохозяйственной практики на окружающую среду. Для выполнения этой амбициозной цели, стратегии, вдохновленные естественной защиты развивались в растениях в настоящее время предлагается, как более 1000 видов растений были выделены для их противомикробныхсвойств 8. Например, растения, которые разработали природные фунгициды для борьбы с фитопатогенами являются новым ресурсом в изучении разработки новых продуктов биоконтроля2. Эфирные масла являются флагманскими молекулами этого типа. Например, эфирное масло Origanum защищает томатные растения от серой плесени в теплицах 10 и Solidago canadensis L. и cassia эфирных масел было показано, чтобы сохранить пост-урожай клубники от повреждения серойплесени 11,12. Эти примеры иллюстрируют, что биоконтроль и, в частности, растительные продукты представляют собой решение, которое сочетает в себе биологическую эффективность и экологическую устойчивость.
Таким образом, растения являются важным ресурсом молекул, представляющих потенциальный интерес для растениеводства. Однако только горстка растительных продуктов были предложены для использования в качестве продуктов биоконтроля, хотя они, как правило, признаются безопасными, нефитотоксические и экологически чистые2. Некоторые трудности в транспозиции из лаборатории в поле наблюдались, такие как снижение эффективности после применения in vivo2,9. Таким образом, становится важным улучшить способность лабораторных тестов лучше прогнозировать эффективность поля. В этом контексте методы противогрибкового тестирования растительных продуктов необходимы как для оценки их противогрибковой эффективности, так и для определения их оптимальных условий для использования. В частности, продукты биоконтроля, как правило, менее эффективны, чем химические фунгициды, поэтому лучшее понимание их способа действия важно для предложения подходящих формулировок, определения способа применения в полях и определения того, какая стадия развития патогена уязвима для биопродукта кандидата.
Современные подходы к борьбе с антибактериальной и противогрибковой деятельностью включают методы диффузии, такие как диффузия агар-диска, разбавление, биоаутография и цитометрия потока13. Большинство из этих методов, и более конкретно, стандартное тестирование противогрибковой восприимчивости - агар-диск диффузии и разбавления анализы - хорошо приспособлены для оценки антимикробной активности растворимых соединений на бактериальных и грибковых спор в жидких суспензиях14. Однако эти методы, как правило, не подходят для тестирования твердых соединений, таких как сушеный растительный порошок или количественной противогрибковой активности во время роста мицелия, поскольку они требуют разбавления спор или споры, распространяющиеся на агарных пластинах и/или разбавления противогрибковых соединений13. В пищевой отравленный метод, агар пластин, содержащих противогрибковое вещество прививаются с 5-7 мм диаметр диска взяты из 7-дневной культуры грибов без рассмотрения точного количества начала мицелия. После инкубации противогрибковая активность определяется как процент радиационно-роста ингибирования17,18,19. При этом подходе мы можем оценить противогрибковую активность на мойцелиальный рост. В отличие от этого, метод разбавления агара выполняется для определения противогрибковой активности на спорах, непосредственно привитых на поверхности агарной пластины, содержащей противогрибковые соединения13,20,21. Эти два подхода дают дополнительные результаты по противогрибковой активности. Однако это два независимых метода, используемых параллельно, которые не обеспечивают точного параллельного сравнения относительной эффективности противогрибковых соединений на споры и мицелий17,20,22 как количество стартового грибкового материала отличается в двух подходах. Кроме того, противогрибковая активность растительного продукта часто является результатом сочетания противогрибковых молекул, синтезированных растениями, для борьбы с патогенными микроорганизмами. Эти молекулы включают белки, пептиды23,24, и метаболиты, имеющие широкое химическое разнообразие и принадлежащие к различным классам молекул, таких как полифенолы, терпены, алькалоиды25, глюкозинолаты8, и органосульфурные соединения26. Некоторые из этих молекул летучих или становятся летучими во время патогенной атаки27. Эти агенты чаще всего плохо водорастворимые и высокого давления пара соединений, которые должны быть восстановлены с помощью дистилляции воды в качестве эфирных масел, некоторые из которых антимикробной деятельности были хорошо установлены28. Анализы опосредованности паровой фазы были разработаны для измерения антимикробной активности летучих соединений после испарения и миграции через фазу пара29. Эти методы основаны на введении противогрибковых соединений на расстоянии от микробной культуры29,30,31,32,33. В обычно используемых пара фазы агара анализ, эфирные масла откладываются на бумажном диске и помещается в центре крышки чашки Петри на расстоянии от бактериальных или грибковых спор подвески, которая распространяется на агар среды. Диаметр зоны ингибирования роста измеряется так же, как и метод диффузии агар-диска20,24. Были разработаны другие подходы для количественного измерения противогрибковой восприимчивости эфирных масел к паровой фазе, полученной на основе метода разбавления бульона, из которого была рассчитана ингибирующая паровая фаза опосредованная противомикробная активность32, или полученных из агар-диск диффузии анализы31. Эти методы, как правило, специфичны для исследований паровой фазы активности и не подходят для анализа контактных ингибиции. Это исключает определение относительного вклада летучих и нестационатных веществ в противогрибковую активность сложной биоактивной смеси.
Количественный метод, который мы разработали, направлен на измерение противогрибкового эффекта сухого растительного порошка на контролируемые количества спор и выращенного мицелия, отложенного на поверхности агар-среды, чтобы воспроизвести воздушный рост фитопатогеновво время заражения растений 15, а также взаимосвязанной мицелиальнойсети 16. Этот подход является модифицированной экспериментальной установкой, основанной на методах разбавления агара и пищевых отравленных продуктов, что также позволяет в той же экспериментальной установке количественно оценить вклад как летучих, так и нестационарных противогрибковых метаболитов. В этом исследовании метод был схвеирован с активностью трех хорошо охарактеризованных противогрибковых препаратов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave-vacuclav 24B+</td>
			<td>Melag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbendazim</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>378674-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>547254</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five millimeters diameter stainless steel tube</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food dehydrator</td>
			<td>Sancusto</td>
			<td></td>
			<td>six trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic powder</td>
			<td>Organic shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>CLOUP</td>
			<td>65020</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer counting cell</td>
			<td>Jeulin</td>
			<td>713442</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&#160;UM400</td>
			<td>30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife mill</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>TSM6A013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>HCNT-001-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring ruler</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinets</td>
			<td>FASTER</td>
			<td></td>
			<td>FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014407</td>
			<td>100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014411</td>
			<td>20 - 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014412</td>
			<td>2 - 20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1194500</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1473&#160;</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controllers-EASY 60</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>EASY-P60-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>70139-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale-RADWAG</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>B126698</td>
			<td>AS220.R2-ML 220g/0.1mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rake</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86-1569001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse microscope AE31E trinocular</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>M097917</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile graduated pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>1254001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymus essential oil</td>
			<td>Drugstore</td>
			<td></td>
			<td>Essential oil 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.762010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth pick</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichoderma spp strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strain of LRPIA laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>FORS-001-002</td>
			<td>/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products

Описанный протокол основан на методе передачи плагинов, который позволяет точно определить количество микроорганизмов и их стадии развития. Определенное количество спор распространяется на агар-пластину. Эта агарная пластина инкубируется в течение определенного периода, чтобы позволить грибам достичь ожидаемой стадии развития, за исключением спор, где инкубация не требуется. Агар пробки, покрытые спорами, гифа, или мицелий затем сняты и переданы на агар сми, содержащие противогрибковые соединения для тестирования либо размещены на расстоянии от грибов или в контакте. Этот метод применим для тестирования как жидких экстрактов, так и твердых образцов (порошков). Он особенно хорошо подходит для количественной оценки относительного вклада летучих и не летучих веществ в биологически активных смесях и для определения их воздействия, в частности на споры, раннюю гифе и мицелий.
Метод крайне актуален для характеристики противогрибковой активности продуктов биоконтроля, в частности продуктов растительного происхождения. Действительно, для обработки растений, результаты могут быть использованы для руководства выбор способа применения и установить триггерные пороги.

Чтобы оценить способность количественного метода различать способ действия различных видов противогрибковых соединений, мы сравнили эффективность трех известных противогрибковых препаратов. Карбендазим является не летучих синтетических фунгицидов, который широко используется дл?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products at JoVE.com

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Мы описываем модифицированный метод на основе агара, предназначенный для количественной оценки противогрибкового воздействия растительных продуктов. С помощью этого протокола можно оценить как летучий, так и нестабильный вклад в противогрибковую активность. Кроме того, эффективность против грибов может быть измерена на ключевых стадиях развития в одной экспериментальной установке.

Измерение летучих и нестациональных противогрибковых действий продуктов биоконтроля

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

This protocol provides a method for making accurate side-by-side comparisons of the relative efficacy of volatile and non-volatile antifungal compounds at different fungal growth stages. This method is well-suited for evaluating the antifungal activity of plant-derived products used in dried or liquid forms that contain a wide diversity of molecules. This method can provide valuable information about the mode of application of plant-derived products and is particularly well-suited in the field of biocontrol.Demonstrating the procedure will be Valentina Gligorijevic, an engineer assistant from the Sup'Biotech laboratory. For conidia collection, layer three milliliters of 0.05%Tween 20 on a trichoderma mycelium culture and use a rake to release the conidia from the conidiophores taking care not to press down on the mycelium to prevent the hyphae from being torn away. When all of the conidia have been released, use a micropipette to quickly recover and add the conidia solution to a 15 milliliter tube for counting.To prepare fungal plates, deposit 100 microliters of spores at a three times 10 to the six spores per milliliter concentration onto a nine centimeter Petri dish containing PDA medium, and use a sterile spatula to add 10 grams of two millimeter diameter glass beads to the plate. Then gently shake the plate forward and backward and spin and rotate the plate in 90 degree segments until it has been fully rotated to evenly distribute the spores across the surface of the agar. Then incubate the plate at 30 degrees Celsius until growth inhibition analysis.To perform a contact-inhibition assay with garlic powder, use a sterile spatula to weigh the desired garlic powder quantity into individual 50 milliliter tubes. to obtain concentrations generally ranging from 0.25 to 16 milligrams per milliliter. Add 10 milliliters of approximately 45 degrees Celsius PDA to each tube and carefully invert each tube several times to evenly distribute the powder throughout the agar.Quickly, pour the homogenized suspensions into five centimeter diameter Petri dishes and allow the agar to solidify at room temperature. To perform a contact-inhibition assay, use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the agar in the control and antifungal compound-treated dishes, and use a sterile toothpick to dispose of the agar cylinders. Next, use a new five millimeter diameter stainless steel tube to plot 15 to 20 circles randomly into the fungal plates, and use sterile toothpicks to carefully transfer the spore, hyphae, or mycelium-covered cylinders into the empty regions of the PDA plates.Then return the plates to the 30 degree Celsius incubator. To prepare a plates for a vapor-phase antifungal inhibition assay, pour 10 milliliters of PDA medium into the lid of a five centimeter diameter Petri dish containing 10 milliliters of PDA medium containing antifungal compounds or PDA medium alone, and allow the agar to solidify at room temperature. Using a 50 milliliter centrifical tube as a calibration tool, make a circle of PDA in the center of the agar and use a sterile spatula to remove the agar around the circle.Use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the medium in the lid and use a sterile toothpick to discard the auger cylinder. Then use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to randomly make plugs in the prepared fungal plates, and use a sterile toothpick to carefully transfer spore, hyphae, or mycelium-coated plugs into the lids of the assay plates. In this analysis, trichoderma species SBT 10-2018 growth inhibition triggered by three antifungal compounds was evaluated using contact and vapor-phase inhibition assays as demonstrated for each fungal stage.A higher spore sensitivity to carbendazim was observed compared to early hyphae and mycelium networks when trichoderma and antifungal compounds were in contact. In contrast, carbendozim had no antifungal effect on trichoderma when the fungus was placed at a distance from the fungicide in accordance with the low volatility of this substance. When thymus vulgaris essential oil was used as an antifungal compound, a higher sensitivity was observed for spores and early hyphae as compared to mycelium growth inhibition at 0.025%essential oil.As expected, thymus vulgaris essential oil presented identical antifungal activity irrespective of the distance between the fungus and the oil. When garlic powder was used, a higher efficacy was observed against spore germination and early hyphae elongation than for mycellium growth. Particular attention must be paid during the fungal plate preparation to make sure that the spores are evenly distributed on the surface of the agar plate to ensure comparable results.

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Измерение потоков минеральных питательных веществ и токсикантов в растениях с помощью радиоактивной метки

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Измерение углерода на основе Загрязняющие Минерализация Использование Совмещенный CO<sub&gt; 2</sub&gt; Flux и Радиоуглеродный анализ

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Измерение и сопоставление моделей осаждения, относящиеся к концентрации карбоната почвы под управление сельским хозяйством и эрозии почвы

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

Эффект от применения эфирное масло тимьяна микробной нагрузки во время сушки мяса

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Методы доставки двуцепочечной РНК Оральный побудить РНК-интерференции в флоэма и членистохоботные насекомых, растений sap питание

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Measuring Stolons and Rhizomes of Turfgrasses Using a Digital Image Analysis System

Измерения столонов и корневищ Turfgrasses с помощью системы анализа цифровых изображений

Length and diameter of stolons or rhizomes are usually measured using simple rulers and calipers. This procedure is slow and laborious, so it is often ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

Петля опосредованной Assay изотермической амплификация (лампа) для быстрой идентификации Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

Отдельные лист ассы для упрощения исследования экспрессии генов в картофель во время заражения жевательного насекомого Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Xylem Распределение воды в Древесных растениях, визуализированных с крио-сканирования электронный микроскоп

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

Измерение ферментативные стабильности путем изотермического титрования калориметрия

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...