Name: measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products
Uploaded: 2020-12-05T14:00:00
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Estamos muy agradecidos a Frank Yates por su precioso consejo. Este trabajo fue apoyado por Sup'Biotech.

1. Preparación de Inocula
<ol><li>Antes del experimento, poner 5 μL de Trichoderma spp. Esporas SBT10-2018 almacenadas a 4 °C en medio agar dextrosa de patata (PDA) e incubar durante 4 días a 30 °C con exposición a la luz regular para promover la formación de conidia42 (Figura 1,panel A). NOTA: Trichoderma spp. SBT10-2018 ha sido aislado de la madera y se utiliza como modelo en este estudio por su rápido crecimiento y facilidad de recupe...

El enfoque presentado aquí permite la evaluación de las propiedades antifúngicas de los productos derivados de plantas mínimamente procesados. En este protocolo, la distribución homogénea de esporas en la superficie del agar se logra utilizando cuentas de vidrio de 2 mm. Este paso requiere habilidades de manejo para distribuir correctamente las cuentas y obtener resultados reproducibles, permitiendo en última instancia la comparación de efectos antifúngicos en diferentes etapas de crecimiento fúngico. Encontram...

Las pérdidas globales de frutas y verduras pueden alcanzar hasta el 50% de la producción1 y resultar principalmente de la descomposición de los alimentos causada por el deterioro de hongos en el campo o durante el almacenamiento posterior a la cosecha2,3,a pesar del amplio empleo de fungicidas sintéticos desde mediados del siglo XX4. El uso de estas sustancias se está reconsiderando, ya que representa graves riesgos ambientales y para la salud. A medida que las consecuencias dañinas de su uso están apareciendo en todos los ecosistemas y la evidencia de posibles impactos en la salud ha acumulado5,6,nuevas alternativas a las viejas estrategias profilácticas se están desarrollando para los tratamientos pre y post-cosecha7,8,9. De ahí que el reto al que nos enfrentamos sea doble. En primer lugar, las nuevas estrategias fungicidas deben mantener los niveles de eficacia de la protección alimentaria contra los fitopatógenos y, en segundo lugar, contribuir a reducir drásticamente la huella ambiental de las prácticas agrícolas. Para cumplir con este ambicioso objetivo, se están proponiendo estrategias inspiradas en las defensas naturales evolucionadas en las plantas, ya que se han destacado más de 1000 especies de plantas por sus propiedades antimicrobianas8. Por ejemplo, las plantas que han desarrollado fungicidas naturales para luchar contra los fitopatógenos son un recurso novedoso para explorar el desarrollo de nuevos productos de biocontrol2. Los aceites esenciales son moléculas emblemáticas de este tipo. Por ejemplo, el aceite esencial origanum protege las plantas de tomate contra el moho gris en invernaderos 10 y se ha demostrado que los aceites esenciales de solidago canadensis L. y cassia preservan las fresas postcosechadas de daños en el moho gris11,12. Estos ejemplos ilustran que el biocontrol y, en particular, los productos derivados de plantas representan una solución que combina eficacia biológica y sostenibilidad ambiental.
Por lo tanto, las plantas son un recurso importante de moléculas de interés potencial para la industria de protección de cultivos. Sin embargo, sólo se ha propuesto que un puñado de productos vegetales se utilicen como productos de biocontrol, aunque generalmente se les reconoce como seguros, no fitotóxicos y respetuosos con el medio ambiente2. Se han observado algunas dificultades en la transposición desde el laboratorio al campo, como la disminución de la eficacia una vez aplicada in vivo2,9. Por lo tanto, se vuelve importante mejorar la capacidad de las pruebas de laboratorio para predecir mejor la eficacia del campo. En este contexto, los métodos de ensayo antifúngicos para productos derivados de plantas son necesarios tanto para evaluar su eficacia antifúngica como para definir sus condiciones óptimas de uso. Específicamente, los productos de biocontrol son generalmente menos eficientes que los fungicidas químicos, por lo que es importante una mejor comprensión de su modo de acción para proponer formulaciones adecuadas, identificar el modo de aplicación en los campos y definir qué etapa de desarrollo del patógeno es vulnerable al bioproducto candidato.
Los enfoques actuales que abordan las actividades antibacterianas y antifúngicas incluyen métodos de difusión como la difusión de agar-disco, dilución, bioautografía y citometría de flujo13. La mayoría de estas técnicas, y más específicamente, las pruebas estándar de susceptibilidad antifúnggica - ensayos de difusión y dilución de disco de agar - están bien adaptadas para evaluar la actividad antimicrobiana de compuestos solubles en esporas bacterianas y fúngicas en suspensiones líquidas14. Sin embargo, estos métodos generalmente no son adecuados para probar compuestos sólidos como el polvo vegetal seco o cuantificar la actividad antifúngica durante el crecimiento del micelio, ya que requieren dilución de esporas o esporas que se extienden en placas de agar y/o dilución de compuestos antifúngicos13. En el método envenenado por alimentos, las placas de agar que contienen el agente antifúngico se inoculan con un disco de 5-7 mm de diámetro muestreado a partir de un cultivo de hongos de 7 días de antigüedad sin tener en cuenta la cantidad precisa de micelio inicial. Después de la incubación, la actividad antifúngica se determina como un porcentaje de la inhibición del crecimiento radial17,18,19. Con este enfoque podemos evaluar la actividad antifúnggica en el crecimiento micelial. Por el contrario, se realiza el método de dilución del agar para determinar la actividad antifúngica en esporas directamente inoculadas en la superficie de la placa de agar que contiene los compuestos antifúngicos13,20,21. Estos dos enfoques dan resultados complementarios sobre la actividad antifúnggica. Sin embargo, se trata de dos técnicas independientes utilizadas en paralelo que no proporcionan una comparación precisa en paralelo de la eficacia relativa de los compuestos antifúngicos en esporas y micelio17,20,22 a medida que la cantidad de material fúngico inicial difiere en los dos enfoques. Además, la actividad antifúngica de un producto derivado de la planta a menudo es el resultado de la combinación de moléculas antifúngicas sintetizadas por las plantas para hacer frente a patógenos. Estas moléculas abarcan proteínas, péptidos23,24, y metabolitos con amplia diversidad química y pertenecientes a diferentes clases de moléculas como polifenoles, terpenos, alcaloïds25, glucosinolatos8, y compuestos de organosulfur26. Algunas de estas moléculas son volátiles o se vuelven volátiles durante el ataque de patógenos27. Estos agentes suelen ser compuestos solubles en agua y de alta presión de vapor que deben recuperarse a través de la destilación de agua como aceites esenciales, algunas de cuyas actividades antimicrobianas han sido bien establecidas28. Se han desarrollado ensayos de susceptibilidad mediada en fase de vapor para medir la actividad antimicrobiana de compuestos volátiles después de la evaporación y migración a través de la fase de vapor29. Estos métodos se basan en la introducción de compuestos antifúngicos a distancia del cultivo microbiano29,30,31,32,33. En el ensayo de agar de fase de vapor comúnmente utilizado, los aceites esenciales se depositan en un disco de papel y se colocan en el centro de la cubierta de la placa De Petri a distancia de la suspensión de esporas bacterianas o fúngicas, que se propaga en medio de agar. El diámetro de la zona de inhibición del crecimiento se mide de la misma manera que para el método de difusión del agar-disco20,24. Se han desarrollado otros enfoques para proporcionar medición cuantitativa de la susceptibilidad antifúngica de la fase de vapor de los aceites esenciales, derivada del método de dilución de caldos a partir del cual se calculó una actividad antimicrobiana mediada en fase de vapor inhibitorio32, o derivado de ensayos de difusión de agar-disco31. Estos métodos son generalmente específicos de los estudios de actividad de fase de vapor y no son apropiados para los ensayos de inhibición de contacto. Esto excluye la determinación de la contribución relativa de agentes volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica de una mezcla bioactiva compleja.
El método cuantitativo que hemos desarrollado tiene como objetivo medir el efecto antifúngico del polvo de planta seca en cantidades controladas de esporas y micelio cultivado depositado en la superficie de un medio de agar para reproducir el crecimiento aéreo de fitopatógenos durante la infección de las plantas15, así como una red micelial interconectada16. El enfoque es una configuración experimental modificada basada en la dilución del agar y los métodos envenenados por alimentos que también permite, en la misma configuración experimental, cuantificar en paralelo la contribución de metabolitos antifúngicos volátiles y no volátiles. En este estudio, el método ha sido comparado con la actividad de tres preparaciones antifúngicas bien caracterizadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave-vacuclav 24B+</td>
			<td>Melag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbendazim</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>378674-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>547254</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five millimeters diameter stainless steel tube</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food dehydrator</td>
			<td>Sancusto</td>
			<td></td>
			<td>six trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic powder</td>
			<td>Organic shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>CLOUP</td>
			<td>65020</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer counting cell</td>
			<td>Jeulin</td>
			<td>713442</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&#160;UM400</td>
			<td>30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife mill</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>TSM6A013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>HCNT-001-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring ruler</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinets</td>
			<td>FASTER</td>
			<td></td>
			<td>FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014407</td>
			<td>100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014411</td>
			<td>20 - 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014412</td>
			<td>2 - 20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1194500</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1473&#160;</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controllers-EASY 60</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>EASY-P60-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>70139-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale-RADWAG</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>B126698</td>
			<td>AS220.R2-ML 220g/0.1mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rake</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86-1569001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse microscope AE31E trinocular</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>M097917</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile graduated pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>1254001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymus essential oil</td>
			<td>Drugstore</td>
			<td></td>
			<td>Essential oil 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.762010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth pick</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichoderma spp strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strain of LRPIA laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>FORS-001-002</td>
			<td>/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products

El protocolo descrito se basa en una técnica de transferencia plug-transfer que permite la determinación precisa de las cantidades de microorganismos y sus etapas de desarrollo. Un número especificado de esporas se extienden en una placa de agar. Esta placa de agar se incuba durante un período definido para permitir que los hongos lleguen a la etapa de desarrollo esperada, excepto para las esporas donde no se requiere incubación. Los tapones de agar cubiertos por esporas, hifas o micelio se retiran y transfieren a continuación a los medios de agar que contienen el compuesto antifúngico para ser probados a distancia de los hongos o en contacto. Este método es aplicable para probar extractos líquidos y muestras sólidas (polvos). Es particularmente adecuado para cuantificar las contribuciones relativas de los agentes volátiles y no volátiles en las mezclas bioactivas y para determinar sus efectos, específicamente en esporas, hifas tempranas y micelio.
El método es altamente relevante para la caracterización de la actividad antifúngica de los productos de biocontrol, en particular los productos derivados de plantas. De hecho, para el tratamiento de plantas, los resultados se pueden utilizar para guiar la elección del modo de aplicación y para establecer los umbrales de activación.

Para evaluar la capacidad del método cuantitativo para discriminar el modo de acción de diferentes tipos de compuestos antifúngicos, comparamos la eficacia de tres agentes antifúngicos conocidos. Carbendazim es un fungicida sintético no volátil que ha sido ampliamente utilizado para controlar una amplia gama de enfermedades fúngicas en las plantas39,40. El aceite esencial Thymus vulgaris ha sido descrito en gran medida por su actividad antibacteri...

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Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Describimos un método modificado basado en agar diseñado para cuantificar los efectos antifúngicos de los productos derivados de plantas. Las contribuciones volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica se pueden evaluar a través de este protocolo. Además, la eficacia contra hongos se puede medir en etapas clave del desarrollo en una sola configuración experimental.

Medición de la actividad antifúngica volátil y no volátil de los productos biocontrol

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

This protocol provides a method for making accurate side-by-side comparisons of the relative efficacy of volatile and non-volatile antifungal compounds at different fungal growth stages. This method is well-suited for evaluating the antifungal activity of plant-derived products used in dried or liquid forms that contain a wide diversity of molecules. This method can provide valuable information about the mode of application of plant-derived products and is particularly well-suited in the field of biocontrol.Demonstrating the procedure will be Valentina Gligorijevic, an engineer assistant from the Sup'Biotech laboratory. For conidia collection, layer three milliliters of 0.05%Tween 20 on a trichoderma mycelium culture and use a rake to release the conidia from the conidiophores taking care not to press down on the mycelium to prevent the hyphae from being torn away. When all of the conidia have been released, use a micropipette to quickly recover and add the conidia solution to a 15 milliliter tube for counting.To prepare fungal plates, deposit 100 microliters of spores at a three times 10 to the six spores per milliliter concentration onto a nine centimeter Petri dish containing PDA medium, and use a sterile spatula to add 10 grams of two millimeter diameter glass beads to the plate. Then gently shake the plate forward and backward and spin and rotate the plate in 90 degree segments until it has been fully rotated to evenly distribute the spores across the surface of the agar. Then incubate the plate at 30 degrees Celsius until growth inhibition analysis.To perform a contact-inhibition assay with garlic powder, use a sterile spatula to weigh the desired garlic powder quantity into individual 50 milliliter tubes. to obtain concentrations generally ranging from 0.25 to 16 milligrams per milliliter. Add 10 milliliters of approximately 45 degrees Celsius PDA to each tube and carefully invert each tube several times to evenly distribute the powder throughout the agar.Quickly, pour the homogenized suspensions into five centimeter diameter Petri dishes and allow the agar to solidify at room temperature. To perform a contact-inhibition assay, use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the agar in the control and antifungal compound-treated dishes, and use a sterile toothpick to dispose of the agar cylinders. Next, use a new five millimeter diameter stainless steel tube to plot 15 to 20 circles randomly into the fungal plates, and use sterile toothpicks to carefully transfer the spore, hyphae, or mycelium-covered cylinders into the empty regions of the PDA plates.Then return the plates to the 30 degree Celsius incubator. To prepare a plates for a vapor-phase antifungal inhibition assay, pour 10 milliliters of PDA medium into the lid of a five centimeter diameter Petri dish containing 10 milliliters of PDA medium containing antifungal compounds or PDA medium alone, and allow the agar to solidify at room temperature. Using a 50 milliliter centrifical tube as a calibration tool, make a circle of PDA in the center of the agar and use a sterile spatula to remove the agar around the circle.Use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the medium in the lid and use a sterile toothpick to discard the auger cylinder. Then use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to randomly make plugs in the prepared fungal plates, and use a sterile toothpick to carefully transfer spore, hyphae, or mycelium-coated plugs into the lids of the assay plates. In this analysis, trichoderma species SBT 10-2018 growth inhibition triggered by three antifungal compounds was evaluated using contact and vapor-phase inhibition assays as demonstrated for each fungal stage.A higher spore sensitivity to carbendazim was observed compared to early hyphae and mycelium networks when trichoderma and antifungal compounds were in contact. In contrast, carbendozim had no antifungal effect on trichoderma when the fungus was placed at a distance from the fungicide in accordance with the low volatility of this substance. When thymus vulgaris essential oil was used as an antifungal compound, a higher sensitivity was observed for spores and early hyphae as compared to mycelium growth inhibition at 0.025%essential oil.As expected, thymus vulgaris essential oil presented identical antifungal activity irrespective of the distance between the fungus and the oil. When garlic powder was used, a higher efficacy was observed against spore germination and early hyphae elongation than for mycellium growth. Particular attention must be paid during the fungal plate preparation to make sure that the spores are evenly distributed on the surface of the agar plate to ensure comparable results.

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