Name: measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products
Uploaded: 2020-12-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products at JoVE.com

Vi är mycket tacksamma mot Frank Yates för hans värdefulla råd. Detta arbete stöddes av Sup'Biotech.

1. Inokula beredning
<ol><li>Före experimentet, lägg 5 μL Trichoderma spp. SBT10-2018 sporer lagrade vid 4 °C på potatisdextrosa agar medium (PDA) och inkubera i 4 dagar vid 30 °C med regelbunden ljusexponering för att främja konidiabildning42 (figur 1, panel A). OBS: Trichoderma spp. SBT10-2018 har isolerats från trä och används som modell i denna studie för sin snabba tillväxt och enkla sporåtervinning. Denna stam bevaras av vår...

Det tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör utvärdering av svampdödande egenskaper hos minimalt bearbetade växtbaserade produkter. I detta protokoll uppnås homogen fördelning av sporer på agarytan med hjälp av 2 mm glaspärlor. Detta steg kräver hanteringsförmåga för att korrekt fördela pärlorna och få reproducerbara resultat, vilket i slutändan gör det möjligt att jämföra svampdödande effekter i olika stadier av svamptillväxt. Vi fann att 5 mm glaspärlor eller överdriven rotation und...

Globala förluster av frukt och grönsaker kan nå upp till 50% av produktionen1 och resultera främst från matförfall orsakad av svampförstöring i fält eller under lagringefter skörden 2,3, trots den omfattande sysselsättningen av syntetiska fungicider sedan mitten av 1900-talet4. Användningen av dessa ämnen omprövas eftersom den utgör allvarliga miljö- och hälsorisker. Eftersom de skadliga konsekvenserna av deras användning dyker upp i hela ekosystemen och bevis på potentiella hälsoeffekter har ackumulerats5,6, utvecklas nya alternativ till gamla profylaktiska strategier för behandlingar före och efterskörden 7,8,9. Därför är utmaningen vi står inför dubbel. Nya fungicidstrategier måste för det första bibehålla effektiviteten hos livsmedelsskyddet mot fytopatogener och samtidigt, för det andra, bidra till att dramatiskt minska jordbruksmetoders miljöavtryck. För att uppfylla detta ambitiösa mål föreslås strategier inspirerade av det naturliga försvaret som utvecklats i växter eftersom mer än 1000 växtarter har lyfts fram för sina antimikrobiella egenskaper8. Till exempel är växter som har utvecklat naturliga fungicider för att bekämpa fytopatogener en ny resurs för att utforska utvecklingen av nya biokontrollprodukter2. Eteriska oljor är flaggskeppsmolekyler av denna typ. Till exempel skyddar Origanum eterisk olja tomatplantor mot gråmögel i växthus 10 och Solidago canadensis L. och fatias eteriska oljor har visat sig bevara efterskördade jordgubbar från grå mögelskador11,12. Dessa exempel visar att biokontroll och särskilt växtbaserade produkter utgör en lösning som kombinerar biologisk effektivitet och miljömässig hållbarhet.
Växter är således en viktig resurs för molekyler av potentiellt intresse för växtskyddsindustrin. Endast en handfull vegetabiliska produkter har dock föreslagits användas som biokontrollprodukter trots att de allmänt erkänns som säkra, icke-fytotoxiska och miljövänliga2. Vissa svårigheter i införlivandet från labbet till fältet har observerats, såsom effekt minska när tillämpas in vivo2,9. Således blir det viktigt att förbättra laboratorietesternas förmåga att bättre förutsäga fälteffektiviteten. I detta sammanhang är svampdödande testmetoder för växtbaserade produkter nödvändiga både för att utvärdera deras svampdödande effekt och för att definiera deras optimala användningsvillkor. Specifikt är biokontrollprodukter i allmänhet mindre effektiva än kemiska fungicider, så en bättre förståelse av deras verkningssätt är viktigt för att föreslå lämpliga formuleringar, för att identifiera användningssättet inom fält och för att definiera vilket utvecklingsstadium av patogenen som är sårbart för den sökande bioprodukten.
Nuvarande metoder för antibakteriella och svampdödande aktiviteter inkluderar diffusionsmetoder som agar-diskdiffusion, utspädning, bioautografi och flödescytometri13. De flesta av dessa tekniker, och mer specifikt standardtestning av antifungal känslighet - agar-disk diffusion och utspädningsanalyser - är väl anpassade för att utvärdera den antimikrobiella aktiviteten hos lösliga föreningar på bakteriella och svampsporer i flytande suspensioner14. Dessa metoder är dock i allmänhet inte lämpliga för att testa fasta föreningar såsom torkat växtpulver eller för att kvantifiera svampdödande aktivitet under myceliumtillväxt eftersom de kräver sporutspädning eller sporspridning på agarplattor och/eller utspädning av svampdödande föreningar.13. I den livsmedelsförgiftade metoden vaccineras agarplattor som innehåller det svampdödande medlet med en 5-7 mm diameter skiva som provtas från en 7-dagars gammal svampkultur utan att ta hänsyn till den exakta mängden start av mycelium. Efter inkubation bestäms den svampdödande aktiviteten som en procent av radiell tillväxthämning17,18,19. Med detta tillvägagångssätt kan vi utvärdera den svampdödande aktiviteten på mycelial tillväxt. Däremot utförs agar-utspädningsmetoden för att bestämma den svampdödande aktiviteten på sporer som direkt inokuleras på ytan av agarplattan som innehåller svampdödande föreningar13,20,21. Dessa två metoder ger kompletterande resultat när det gäller svampdödande verksamhet. Dessa är dock två oberoende tekniker som används parallellt och som inte ger korrekt jämförelse sida vid sida av den relativa effekten av svampdödande föreningar på sporer och mycelium17,20,22 eftersom mängden startsvampmaterial skiljer sig åt i de två metoderna. Dessutom är den svampdödande aktiviteten hos en växtbaserad produkt ofta resultatet av kombinationen av svampdödande molekyler syntetiserade av växter för att möta patogener. Dessa molekyler omfattar proteiner, peptider23,24, och metaboliter med bred kemisk mångfald och som tillhör olika klasser av molekyler såsom polyfenoler, terpener, alcaloïds25, glukosinolater8, och organosulfurföreningar26. Vissa av dessa molekyler är flyktiga eller blir flyktiga under patogenattack27. Dessa medel är oftast dåligt vattenlösliga och högtrycksföreningar som måste återvinnas genom vattendestillation som eteriska oljor, av vilka några av vars antimikrobiella verksamhet har varit väl etablerad28. Ångfasmedierade känslighetsanalyser har utvecklats för att mäta den antimikrobiella aktiviteten hos flyktiga föreningar efter avdunstning och migration via ångfasen29. Dessa metoder är baserade på införandet av svampdödande föreningar på avstånd från den mikrobiella kulturen29,30,31,32,33. I den vanliga ångfasen agaranalys deponeras eteriska oljor på en pappersskiva och placeras i mitten av petriskålens lock på avstånd från bakteriell eller svampsporsuspension, som sprids på agarmedium. Diametern på tillväxthämningszonen mäts sedan på samma sätt som för agar-diskdiffusionsmetoden20,24. Andra metoder har utvecklats för att ge kvantitativ mätning av ångfasens antifunktionella känslighet för eteriska oljor, härledda från den buljongutspädningsmetod från vilken en hämmande ångfasmedierad antimikrobiell aktivitet beräknades32, eller härrör från agar-disk diffusionsanalyser31. Dessa metoder är i allmänhet specifika för aktivitetsstudier i ångfas och är inte lämpliga för kontakthämningsanalyser. Detta utesluter bestämning av det relativa bidraget från flyktiga och icke-flyktiga agenser till den svampdödande aktiviteten hos en komplex bioaktiv blandning.
Den kvantitativa metoden vi har utvecklat syftar till att mäta den svampdödande effekten av torkat växtpulver på kontrollerade mängder sporer och odlat mycelium deponerat på ytan av ett agarmedium för att reproducera flygtillväxten av fytopatogener under infektion avväxter 15 samt ett sammankopplat mycelialnät16. Tillvägagångssättet är en modifierad experimentell inställning baserad på agar-utspädning och livsmedelsförgiftade metoder som också möjliggör, i samma experimentella installation, sida vid sida kvantifiering av bidraget från både flyktiga och icke-flyktiga antifungala metaboliter. I denna studie har metoden benchmarkats mot aktiviteten hos tre väl karakteriserade svampdödande preparat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave-vacuclav 24B+</td>
			<td>Melag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbendazim</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>378674-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>547254</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five millimeters diameter stainless steel tube</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food dehydrator</td>
			<td>Sancusto</td>
			<td></td>
			<td>six trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic powder</td>
			<td>Organic shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>CLOUP</td>
			<td>65020</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer counting cell</td>
			<td>Jeulin</td>
			<td>713442</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&#160;UM400</td>
			<td>30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife mill</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>TSM6A013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>HCNT-001-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring ruler</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinets</td>
			<td>FASTER</td>
			<td></td>
			<td>FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014407</td>
			<td>100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014411</td>
			<td>20 - 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014412</td>
			<td>2 - 20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1194500</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1473&#160;</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controllers-EASY 60</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>EASY-P60-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>70139-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale-RADWAG</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>B126698</td>
			<td>AS220.R2-ML 220g/0.1mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rake</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86-1569001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse microscope AE31E trinocular</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>M097917</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile graduated pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>1254001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymus essential oil</td>
			<td>Drugstore</td>
			<td></td>
			<td>Essential oil 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.762010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth pick</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichoderma spp strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strain of LRPIA laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>FORS-001-002</td>
			<td>/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products

Det beskrivna protokollet bygger på en plug-transfer-teknik som möjliggör noggrann bestämning av mikroorganismkvantiteter och deras utvecklingsstadier. Ett angivet antal sporer sprids på en agarplatta. Denna agarplatta inkuberas under en definierad period för att svamparna ska kunna nå det förväntade utvecklingsstadiet, med undantag för sporer där inkubation inte krävs. Agarpluggar täckta av sporer, hyphae eller mycelium dras sedan tillbaka och överförs till agarmedier som innehåller den svampdödande förening som ska testas antingen placerad på avstånd från svamparna eller i kontakt. Denna metod är tillämplig för att testa både flytande extrakt och fasta prover (pulver). Det är särskilt väl lämpat för kvantifiering av de relativa bidragen från flyktiga och icke-flyktiga medel i bioaktiva blandningar och för att bestämma deras effekter, särskilt på sporer, tidig hyphae och mycelium.
Metoden är mycket relevant för karakteriseringen av biokontrollprodukters svampdödande aktivitet, särskilt växtbaserade produkter. När det gäller växtrening kan resultaten användas för att vägleda valet av användningssätt och för att fastställa tröskelvärdena för utlösande ämnen.

För att utvärdera den kvantitativa metodens förmåga att diskriminera verkningssättet hos olika typer av svampdödande föreningar jämförde vi effekten av tre välkända svampdödande medel. Kardendazim är en icke-flyktig syntetisk fungicid som har använts i stor utsträckning för att kontrollera ett brett spektrum av svampsjukdomar iväxter 39,40. Thymus vulgaris eteriska olja har till stor del beskrivits för sin antibakteriella och svampdöda...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products at JoVE.com

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Vi beskriver en modifierad agarbaserad metod utformad för att kvantifiera de svampdödande effekterna av växtbaserade produkter. Både flyktiga och icke-flyktiga bidrag till den svampdödande verksamheten kan bedömas genom detta protokoll. Dessutom kan effekt mot svampar mätas i viktiga utvecklingsstadier i en enda experimentell installation.

Mätning av biokontrollprodukters flyktiga och icke-flyktiga svampdödande aktivitet

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

This protocol provides a method for making accurate side-by-side comparisons of the relative efficacy of volatile and non-volatile antifungal compounds at different fungal growth stages. This method is well-suited for evaluating the antifungal activity of plant-derived products used in dried or liquid forms that contain a wide diversity of molecules. This method can provide valuable information about the mode of application of plant-derived products and is particularly well-suited in the field of biocontrol.Demonstrating the procedure will be Valentina Gligorijevic, an engineer assistant from the Sup'Biotech laboratory. For conidia collection, layer three milliliters of 0.05%Tween 20 on a trichoderma mycelium culture and use a rake to release the conidia from the conidiophores taking care not to press down on the mycelium to prevent the hyphae from being torn away. When all of the conidia have been released, use a micropipette to quickly recover and add the conidia solution to a 15 milliliter tube for counting.To prepare fungal plates, deposit 100 microliters of spores at a three times 10 to the six spores per milliliter concentration onto a nine centimeter Petri dish containing PDA medium, and use a sterile spatula to add 10 grams of two millimeter diameter glass beads to the plate. Then gently shake the plate forward and backward and spin and rotate the plate in 90 degree segments until it has been fully rotated to evenly distribute the spores across the surface of the agar. Then incubate the plate at 30 degrees Celsius until growth inhibition analysis.To perform a contact-inhibition assay with garlic powder, use a sterile spatula to weigh the desired garlic powder quantity into individual 50 milliliter tubes. to obtain concentrations generally ranging from 0.25 to 16 milligrams per milliliter. Add 10 milliliters of approximately 45 degrees Celsius PDA to each tube and carefully invert each tube several times to evenly distribute the powder throughout the agar.Quickly, pour the homogenized suspensions into five centimeter diameter Petri dishes and allow the agar to solidify at room temperature. To perform a contact-inhibition assay, use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the agar in the control and antifungal compound-treated dishes, and use a sterile toothpick to dispose of the agar cylinders. Next, use a new five millimeter diameter stainless steel tube to plot 15 to 20 circles randomly into the fungal plates, and use sterile toothpicks to carefully transfer the spore, hyphae, or mycelium-covered cylinders into the empty regions of the PDA plates.Then return the plates to the 30 degree Celsius incubator. To prepare a plates for a vapor-phase antifungal inhibition assay, pour 10 milliliters of PDA medium into the lid of a five centimeter diameter Petri dish containing 10 milliliters of PDA medium containing antifungal compounds or PDA medium alone, and allow the agar to solidify at room temperature. Using a 50 milliliter centrifical tube as a calibration tool, make a circle of PDA in the center of the agar and use a sterile spatula to remove the agar around the circle.Use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to plot a circle in the center of the medium in the lid and use a sterile toothpick to discard the auger cylinder. Then use a five millimeter diameter sterile stainless steel tube to randomly make plugs in the prepared fungal plates, and use a sterile toothpick to carefully transfer spore, hyphae, or mycelium-coated plugs into the lids of the assay plates. In this analysis, trichoderma species SBT 10-2018 growth inhibition triggered by three antifungal compounds was evaluated using contact and vapor-phase inhibition assays as demonstrated for each fungal stage.A higher spore sensitivity to carbendazim was observed compared to early hyphae and mycelium networks when trichoderma and antifungal compounds were in contact. In contrast, carbendozim had no antifungal effect on trichoderma when the fungus was placed at a distance from the fungicide in accordance with the low volatility of this substance. When thymus vulgaris essential oil was used as an antifungal compound, a higher sensitivity was observed for spores and early hyphae as compared to mycelium growth inhibition at 0.025%essential oil.As expected, thymus vulgaris essential oil presented identical antifungal activity irrespective of the distance between the fungus and the oil. When garlic powder was used, a higher efficacy was observed against spore germination and early hyphae elongation than for mycellium growth. Particular attention must be paid during the fungal plate preparation to make sure that the spores are evenly distributed on the surface of the agar plate to ensure comparable results.

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Att mäta flöden av mineralnäringsämnen och gifter i Växter med radioaktiva markörer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Mätning kolbaserade miljögifts Mineralisering använder kombinerade CO<sub&gt; 2</sub&gt; Flux och Radiocarbon Analyser

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Mätning och kartläggning mönster jorderosion och nedfall kopplad till jord karbonat koncentrationer Under jordbrukets förvaltning

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

Effekten av tillämpningen av Timjan eterisk olja på mikrobiell belastning under kött torkning

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Dubbelsträngat RNA Oral leveransmetoder att framkalla RNA-interferens i floem och växt-sap-utfodring Ditropis insekter

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Measuring Stolons and Rhizomes of Turfgrasses Using a Digital Image Analysis System

Mäta undervattensstjälken och rhizom av Turfgrasses med hjälp av en Digital bild analyssystem

Length and diameter of stolons or rhizomes are usually measured using simple rulers and calipers. This procedure is slow and laborious, so it is often ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

En Loop-medierad isotermiska amplifiering (lampa) analys för snabb identifiering av Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

Fristående blad analyser för att förenkla gen uttrycks studier i potatis under angrepp genom att tugga insekt Manduca Sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Xylem vatten distribution i Woody växter visualiseras med en Cryo-scanning Electron Mikroskop

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

Mäta enzymatisk stabilitet av isotermiska titrering Kalorimetri

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...