ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Summary

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

Abstract

פפטידוגליקן הוא מרכיב חשוב בדפנות תאי החיידקים ומטרה תאית נפוצה לאנטי-מיקרוביאליים. למרות שהיבטים של מבנה פפטידוגליקן נשמרים למדי בכל החיידקים, קיימת גם שונות ניכרת בין גראם-חיוביים/שליליים ובין מינים. בנוסף, ידועים מספר רב של וריאציות, שינויים או התאמות לפפטידוגליקן שיכולים להתרחש בתוך מין חיידקים בתגובה לשלב הגדילה ו / או גירויים סביבתיים. וריאציות אלה מייצרות מבנה דינמי מאוד הידוע כמשתתף בתפקודים תאיים רבים, כולל גדילה/חלוקה, עמידות לאנטיביוטיקה והימנעות מהגנת המאכסן. כדי להבין את השונות בתוך הפפטידוגליקן, יש לפרק את המבנה הכולל לחלקים המרכיבים אותו (המכונים מורופפטידים) ולהעריך את ההרכב התאי הכולל. Peptidoglycomics משתמשת בספקטרומטריית מסות מתקדמת בשילוב עם ניתוח נתונים ביואינפורמטי רב עוצמה כדי לבחון את הרכב הפפטידוגליקן בפירוט רב. הפרוטוקול הבא מתאר את טיהור הפפטידוגליקן מתרביות חיידקים, רכישת נתוני עוצמת מורופפטיד באמצעות כרומטוגרף נוזלי – ספקטרומטר מסות, וניתוח דיפרנציאלי של הרכב הפפטידוגליקן באמצעות ביואינפורמטיקה.

Introduction

פפטידוגליקן (PG) הוא מאפיין מגדיר של חיידקים המשמש לשמירה על המורפולוגיה של התא, תוך מתן תמיכה מבנית לחלבונים ולרכיבים תאיים אחרים ^1,2. עמוד השדרה של PG מורכב מחומצה מורמית N-אצטיל מקושרת β-1,4 לסירוגין (MurNAc) ו-N-אצטיל גלוקוזאמין (GlcNAc)^1,2. לכל MurNAc יש פפטיד קצר הקשור בשאריות ᴅ-lactyl שניתן להצליב לפפטידים סמוכים המקושרים לדו-סוכר (איור 1A,B). ההצלבה הזו מייצרת מבנה דמוי רשת שמקיף את כל התא, ולעתים קרובות מתייחסים אליו כאל עצם העצה (איור 1C). במהלך סינתזת PG, קודמנים נוצרים בציטופלסמה, ומועברים על פני הממברנה הציטופלזמית על ידי פליפסות. מבשרי משולבים לאחר מכן לתוך PG בוגר על ידי אנזימים transglycosylase ו transpeptidase, אשר מייצרים את הקשרים glycosidic ו peptide, בהתאמה³. עם זאת, לאחר הרכבתם, ישנם אנזימים רבים המיוצרים על ידי החיידקים שמשנים ו/או מפרקים את PG כדי לבצע מספר תהליכים תאיים, כולל גדילה וחלוקה. נוסף על כך, הודגם כי שינויים שונים של PG מעניקים התאמות ספציפיות למתח, לתנאי גדילה וללחץ סביבתי, אשר היו מעורבים באיתות תאי, עמידות אנטי-מיקרוביאלית והתחמקות ממערכת החיסון של המארח⁴. לדוגמה, שינוי נפוץ הוא הוספת קבוצת אצטיל C6 על MurNAc המקנה עמידות על ידי הגבלת הגישה לקישורי גליקן β-1,4 לאנזימי ליזוזים המיוצרים על ידי המאכסן אשר מפרקים PG ^4,5,6. באנטרוקוקסי, החלפה של הטרמינל ᴅ-Ala של שרשרת הצד הפפטידית ב-ᴅ-Lac מעניקה עמידות גדולה יותר לאנטי-מיקרוביאלית, ונקומיצין ^7,8.

הנוהל הכללי לבידוד וטיהור PG נותר כמעט ללא שינוי מאז תואר בשנות השישים⁹. קרומי חיידקים מומסים באמצעות טיפול בחום עם SDS, ולאחר מכן הסרה אנזימטית של חלבונים קשורים, גליקוליפידים ושאריות DNA. לאחר מכן ניתן לעכל את העצה השלמה המטוהרת לרכיבים בודדים על ידי הידרוליזה של קישור β-1,4 בין GlcNAc ו- MurNAc. העיכול הזה מייצר מפרקים של GlcNAc-MurNAc עם כל שינוי מבני ו/או קישורים צולבים שלמים, והם נקראים מורופפטידים (איור 1B).

ניתוח הרכב של PG בוצע בתחילה באמצעות הפרדה כרומטוגרפית נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) כדי לטהר כל מורופפטיד ואחריו זיהוי ידני של מורופפטידים^10,11. זה הוחלף מאז על ידי כרומטוגרפיה נוזלית טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-MS), אשר מגביר את רגישות הגילוי ומקטין את עומס העבודה הידנית של טיהור כל muropeptide בודד. עם זאת, האופי הגוזל זמן ומורכב של זיהוי ידני של muropeptides נשאר גורם מגביל, הפחתת מספר המחקרים שנערכו. בשנים האחרונות עם הופעתן של טכנולוגיות "אומיות", מיצוי תכונות LC-MS אוטומטי הפך לכלי רב עוצמה, המאפשר זיהוי וזיהוי מהיר של תרכובות בודדות בדגימות מורכבות ממערכי נתונים גדולים מאוד. לאחר זיהוי התכונות, תוכנה ביואינפורמטית משווה סטטיסטית את השונות בין הדגימות באמצעות ניתוח דיפרנציאלי המבודד אפילו הבדלים מינימליים בין מערך הנתונים המורכב ומציג אותם באופן גרפי למשתמש. היישום של תוכנת חילוץ תכונות לניתוח הרכב PG רק החל להיחקר 12,13,14 ומשולב לניתוח ביואינפורמטי ¹². בניגוד לאנליזה פרוטאומית הנהנה ממאגרי החלבונים הזמינים המנבאים פיצול פפטידים המאפשר זיהוי אוטומטי לחלוטין, לא קיימת כיום ספריית פיצול עבור פפטידוגליקומיקס. עם זאת, מיצוי תכונות יכול להיות משולב עם מסדי נתונים מבניים ידועים וחזויים כדי לחזות זיהוי muropeptide¹². כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש במיצוי תכונות מבוסס LC-MS בשילוב עם ספריית מורופפטיד לזיהוי אוטומטי וניתוח דיפרנציאלי ביואינפורמטי של הרכב PG (איור 2).