Name: semi-quantitative analysis of peptidoglycan by liquid chromatography mass spectrometry and bioinformatics
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Jennifer Geddes-McAlister e il dottor Anthony Clarke per il loro contributo nel perfezionamento di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni operative del CIHR assegnate a C.M.K (PJT 156111) e da un NSERC Alexander Graham Bell CGS D assegnato a E.M.A. Le figure sono state create su BioRender.com.

1. Preparazione del campione di peptidoglicano
<ol><li>Crescita di colture batteriche NOTA: La crescita delle colture batteriche varierà a seconda delle specie batteriche e delle condizioni di crescita esaminate. I parametri sperimentali da testare definiranno le condizioni di crescita.<ol><li>Coltivare colture batteriche nelle condizioni di crescita richieste per il ceppo batterico e il disegno sperimentale. Coltivare i batteri come colture triplicate (repliche biologiche), cioè tre colonie separ...

<ol>
	<li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+structure+and+architecture.">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).</li><li>Pazos, M., Peters, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan.">Peptidoglycan.</a> Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).</li><li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology.">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).</li><li>Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+strategies+to+preserve+cell+wall+integrity+against+environmental+threats.">Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).</li><li>Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., G&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+pathogenic+staphylococci+so+lysozyme+resistant?+The+peptidoglycan+O-acetyltransferase+OatA+is+the+major+determinant+for+lysozyme+resistance+of+Staphylococcus+aureus.">Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).</li><li>Brott, A. S., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+O-acetylation+as+a+virulence+factor:+its+effect+on+lysozyme+in+the+innate+immune+system.">Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system.</a> Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).</li><li>Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+assay+for+D-Ala-D-Lac:+A+key+intermediate+for+vancomycin+resistance+in+vancomycin-resistant+Enterococci.">A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci.</a> Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).</li><li>Arthur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vivo+incorporation+of+D-lactate+into+peptidoglycan+precursors+of+vancomycin-resistant+Enterococci.">Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).</li><li>Mardarowicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolierung+und+Charakterisierung+des+Murein-Sacculus+von+Brucella.">Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella.</a> Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).</li><li>Glauner, B., H&#246;ltje, J. V., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli.">The composition of the murein of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).</li><li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography.">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).</li><li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycomics+reveals+compositional+changes+in+peptidoglycan+between+biofilm-+and+planktonic-derived+Pseudomonas+aeruginosa.">Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).</li><li>van der Aart, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+of+the+peptidoglycan+composition+in+Streptomyces+coelicolor.">High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).</li><li>Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+automated+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+structure.">Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).</li><li>Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+the+enzymes+catalyzing+the+O-acetylation+of+bacterial+cell+wall+polysaccharides.">Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides.</a> Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).</li><li>Clarke, A. 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D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+biosynthesis+by+desleucyl-oritavancin:+A+quantitative+peptidoglycan+composition+analysis+by+mass+spectrometry.">Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).</li><li>Glauner, B., H&#246;ltje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+pattern+of+the+murein+sacculus+of+Escherichia+coli.">Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).</li><li>Espaillat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemometric+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+reveals+atypical+modifications+that+empower+the+cell+wall+against+predatory+enzymes+and+fly+innate+immunity.">Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).</li><li>Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+peptidoglycan+structural+parameters+in+Gram-negative+bacteria.">Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).</li><li>Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+structural+divergence+among+Thermus+spp.">Cell wall structural divergence among Thermus spp.</a> FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).</li><li>Torrens, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+peptidoglycans+from+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+recovered+from+chronic+and+acute+infections.">Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).</li><li>Antignac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+structural+analysis+of+the+peptidoglycan+of+the+human+pathogen+Neisseria+meningitidis.">Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).</li><li>De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+composition+of+a+highly+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+strain.+The+role+of+penicillin+binding+protein+2A.">Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muropeptides+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+their+role+as+elicitors+of+&#946;-lactam-antibiotic+resistance.">Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of &#946;-lactam-antibiotic resistance.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).</li><li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+Structure.">Peptidoglycan Structure.</a> Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).</li><li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria.">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li></ol>

Questo protocollo descrive un metodo per purificare il peptidoglicano da colture batteriche, processo per il rilevamento di LC-MS e analizzare la composizione utilizzando tecniche bioinformatiche. Qui, ci concentriamo sui batteri Gram-negativi e sarà necessaria qualche leggera modifica per consentire l'analisi dei batteri Gram-positivi.
La preparazione dei muropeptidi è rimasta praticamente la stessa da quando è stata prodotta per la prima volta nel 1960 9,11,15.<sup...

Il peptidoglicano (PG) è una caratteristica distintiva dei batteri che serve a mantenere la morfologia cellulare, fornendo supporto strutturale per proteine e altri componenti cellulari 1,2. La spina dorsale del PG è composta dall'acido N-acetil muramico (MurNAc) alternato β-1,4-e dalla N-acetil glucosamina (GlcNAc)1,2. Ogni MurNAc possiede un peptide corto legato al residuo ᴅ-lattile che può essere reticolato con peptidi adiacenti legati al disaccaride (Figura 1A,B). Questa reticolazione produce una struttura a maglia che comprende l'intera cellula ed è spesso indicata come sacculus (Figura 1C). Durante la sintesi di PG, i precursori vengono generati nel citoplasma e trasportati attraverso la membrana citoplasmatica dalle flippasi. I precursori sono successivamente incorporati nel PG maturo dagli enzimi transglicosilasi e transpeptidasi, che producono rispettivamente i legami glicosidici e peptidici3. Tuttavia, una volta assemblati, ci sono numerosi enzimi prodotti dai batteri che modificano e / o degradano il PG per svolgere una serie di processi cellulari, tra cui la crescita e la divisione. Inoltre, varie modifiche del PG hanno dimostrato di conferire adattamenti specifici per la deformazione, le condizioni di crescita e lo stress ambientale, che sono stati implicati nella segnalazione cellulare, nella resistenza antimicrobica e nell'evasione immunitaria dell'ospite4. Ad esempio, una modifica comune è l'aggiunta di un gruppo acetilico C6 sul MurNAc che conferisce resistenza limitando l'accesso ai legami glicani β-1,4 agli enzimi lisozima prodotti dall'ospite che degradano PG 4,5,6. Negli enterococchi, la sostituzione del terminale ᴅ-Ala della catena laterale peptidica con ᴅ-Lac conferisce una maggiore resistenza all'antimicrobico, vancomicina 7,8.
La procedura generale per l'isolamento e la purificazione del PG è rimasta relativamente invariata da quando è stata descritta negli anni 19609. Le membrane batteriche vengono sciolte attraverso il trattamento termico con SDS, seguito dalla rimozione enzimatica delle proteine legate, dei glicolipidi e del DNA rimanente. Il sacculus intatto purificato può essere successivamente digerito nei singoli componenti mediante idrolisi del legame β-1,4 tra GlcNAc e MurNAc. Questa digestione produce disaccaridi GlcNAc-MurNAc con eventuali modifiche strutturali e/o legami incrociati intatti e sono chiamati muropeptidi (Figura 1B).
L'analisi composizionale del PG è stata inizialmente condotta attraverso la separazione cromatografica liquida ad alta pressione (HPLC) per purificare ciascun muropeptide seguita dall'identificazione manuale dei muropeptidi10,11. Da allora questo è stato sostituito dalla spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida (LC-MS), che aumenta la sensibilità di rilevamento e diminuisce il carico di lavoro manuale di purificazione di ogni singolo muropeptide. Tuttavia, la natura lunga e complessa dell'identificazione manuale dei muropeptidi è rimasta un fattore limitante, riducendo il numero di studi condotti. Negli ultimi anni con l'emergere di tecnologie "omiche", l'estrazione automatizzata delle caratteristiche LC-MS è diventata uno strumento potente, consentendo una rapida rilevazione e identificazione di singoli composti in campioni complessi da set di dati molto grandi. Una volta identificate le caratteristiche, il software bioinformatico confronta statisticamente la variazione tra i campioni utilizzando l'analisi differenziale isolando anche minime differenze tra i complessi set di dati e visualizzandoli graficamente all'utente. L'applicazione di software di estrazione di caratteristiche per l'analisi della composizione PG ha appena iniziato ad essere esplorata 12,13,14 e accoppiata all'analisi bioinformatica 12. A differenza dell'analisi proteomica che beneficia dei database proteici prontamente disponibili che prevedono la frammentazione dei peptidi consentendo un'identificazione completamente automatizzata, attualmente non esiste una libreria di frammentazione per i peptidoglycomics. Tuttavia, l'estrazione delle caratteristiche può essere accoppiata con database strutturali noti e previsti per prevedere l'identificazione del muropeptide12. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'uso dell'estrazione di caratteristiche basata su LC-MS combinata con una libreria di muropeptidi per l'identificazione automatizzata e l'analisi differenziale bioinformatica della composizione PG (Figura 2).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 &#181;m)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>LC-MS data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating mantle controller, Optichem</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-401-788</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Mantle, 1000mL Hemispherical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CG1000008</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for sacculi purification and MS sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibig condenser, 300MM 24/40,</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CG121805</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>for lyophilization of sacculi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magentic stirrer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>90-691-18</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>LC-MS data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-197-9573</td>
			<td>cleanup of sample before MS injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-000-102</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort clamp</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S02629</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round bottom flask - 1 liter pyrex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-250-084</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator model 120</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB120</td>
			<td>for sacculi purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator - micro tip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB4422</td>
			<td>for sacculi purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>sacculi wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge bottles, Ti45</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9691797</td>
			<td>sacculi wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water supply</td>
			<td>City</td>
			<td></td>
			<td>for water cooled condenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemdraw</td>
			<td>Cambridgesoft</td>
			<td></td>
			<td>molecular editor for muropeptide fragmentation prediction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Acquisition</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>running QTOF instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Mass Profiler Professional</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>bioinformatic differential analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Personal Compound Database and Library Manager</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>muropeptide m/z MS database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Profinder</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>recursive feature extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Qualitative analysis</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>viewing MS and MS/MS chromatograms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus</td>
			<td>Max Plank Institute of Biochemistry</td>
			<td></td>
			<td>1D annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP168-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27001-500ML-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS tuning mix - HP0321</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1969-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas (&#62;99% purity)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>NI 5.0UH-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S0489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (dibasic)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (monobasic)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stains-all</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-quantitative analysis of peptidoglycan by liquid chromatography mass spectrometry and bioinformatics

Il peptidoglicano è un componente importante delle pareti cellulari batteriche e un bersaglio cellulare comune per gli antimicrobici. Sebbene gli aspetti della struttura del peptidoglicano siano abbastanza conservati in tutti i batteri, c'è anche una notevole variazione tra Gram-positivi / negativi e tra le specie. Inoltre, ci sono numerose varianti, modifiche o adattamenti noti al peptidoglicano che possono verificarsi all'interno di una specie batterica in risposta alla fase di crescita e / o stimoli ambientali. Queste variazioni producono una struttura altamente dinamica che è nota per partecipare a molte funzioni cellulari, tra cui la crescita / divisione, la resistenza agli antibiotici e l'evitamento della difesa dell'ospite. Per comprendere la variazione all'interno del peptidoglicano, la struttura complessiva deve essere scomposta nelle sue parti costitutive (note come muropeptidi) e valutata per la composizione cellulare complessiva. Peptidoglycomics utilizza la spettrometria di massa avanzata combinata con l'analisi dei dati bioinformatici ad alta potenza per esaminare la composizione del peptidoglicano nei minimi dettagli. Il seguente protocollo descrive la purificazione del peptidoglicano da colture batteriche, l'acquisizione di dati di intensità del muropeptide attraverso uno spettrometro di massa cromatografo liquido e l'analisi differenziale della composizione del peptidoglicano utilizzando la bioinformatica.

La maggiore sensibilità di rilevamento dei macchinari MS unita al potente software di riconoscimento dei picchi ha migliorato la capacità di isolare, monitorare e analizzare le composizioni di sostanze di campioni complessi con dettagli molto minuti. Utilizzando questi progressi tecnologici, recenti studi sulla composizione del peptidoglicano hanno iniziato a utilizzare tecniche automatizzate di estrazione delle caratteristiche LC-MS 12,13,14,24 rispetto alla vecchia metodologia basata su HPLC <...

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Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Questo protocollo copre un'analisi dettagliata della composizione del peptidoglicano utilizzando la spettrometria di massa per cromatografia liquida abbinata a software avanzati di estrazione delle caratteristiche e analisi bioinformatica.

Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Ricerca

Biochimica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di<em&gt; Staphylococcus aureus</em

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Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

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Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II

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Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...