Name: semi-quantitative analysis of peptidoglycan by liquid chromatography mass spectrometry and bioinformatics
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Дженнифер Геддес-Макалистер и доктора Энтони Кларка за их вклад в совершенствование этого протокола. Эта работа была поддержана операционными грантами CIHR, присужденными C.M.K (PJT 156111), и NSERC Alexander Graham Bell CGS D, присужденным E.M.A. Рисунки были созданы BioRender.com.

1. Подготовка образцов пептидогликана
<ol><li>Рост бактериальных культур ПРИМЕЧАНИЕ: Рост бактериальных культур будет варьироваться в зависимости от вида бактерий и исследуемых условий роста. Экспериментальные параметры, которые будут тестироваться, будут определять услови?...

<ol>
	<li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+structure+and+architecture.">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).</li><li>Pazos, M., Peters, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan.">Peptidoglycan.</a> Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).</li><li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology.">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).</li><li>Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+strategies+to+preserve+cell+wall+integrity+against+environmental+threats.">Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).</li><li>Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., G&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+pathogenic+staphylococci+so+lysozyme+resistant?+The+peptidoglycan+O-acetyltransferase+OatA+is+the+major+determinant+for+lysozyme+resistance+of+Staphylococcus+aureus.">Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).</li><li>Brott, A. S., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+O-acetylation+as+a+virulence+factor:+its+effect+on+lysozyme+in+the+innate+immune+system.">Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system.</a> Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).</li><li>Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+assay+for+D-Ala-D-Lac:+A+key+intermediate+for+vancomycin+resistance+in+vancomycin-resistant+Enterococci.">A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci.</a> Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).</li><li>Arthur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vivo+incorporation+of+D-lactate+into+peptidoglycan+precursors+of+vancomycin-resistant+Enterococci.">Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).</li><li>Mardarowicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolierung+und+Charakterisierung+des+Murein-Sacculus+von+Brucella.">Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella.</a> Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).</li><li>Glauner, B., H&#246;ltje, J. V., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli.">The composition of the murein of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).</li><li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography.">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).</li><li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycomics+reveals+compositional+changes+in+peptidoglycan+between+biofilm-+and+planktonic-derived+Pseudomonas+aeruginosa.">Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).</li><li>van der Aart, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+of+the+peptidoglycan+composition+in+Streptomyces+coelicolor.">High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).</li><li>Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+automated+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+structure.">Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).</li><li>Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+the+enzymes+catalyzing+the+O-acetylation+of+bacterial+cell+wall+polysaccharides.">Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides.</a> Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).</li><li>Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+peptidoglycan+by+high-performance+anion-exchange+chromatography.">Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).</li><li>Rusconi, F., Douard Valton, &. #. 2. 0. 1. ;., Nguyen, R., Dufourc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sodium+dodecyl+sulfate+in+microliter-volume+biochemical+samples+by+visible+light+spectroscopy.">Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy.</a> Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).</li><li>Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+fragmentation+of+Escherichia+coli+sacculi+by+sonication.">Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication.</a> Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+false+discovery+rate:+A+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing.">Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Juli&#224;, A., James Carroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+in+untargeted+metabolomics:+state+of+the+art+in+2015.">Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).</li><li>Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+and+modeling+of+mass+spectrometry-based+metabolomics+data.">Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1D+and+2D+annotation+enrichment:+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data.">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, 12 (2012).</li><li>Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+biosynthesis+by+desleucyl-oritavancin:+A+quantitative+peptidoglycan+composition+analysis+by+mass+spectrometry.">Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).</li><li>Glauner, B., H&#246;ltje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+pattern+of+the+murein+sacculus+of+Escherichia+coli.">Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).</li><li>Espaillat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemometric+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+reveals+atypical+modifications+that+empower+the+cell+wall+against+predatory+enzymes+and+fly+innate+immunity.">Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).</li><li>Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+peptidoglycan+structural+parameters+in+Gram-negative+bacteria.">Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).</li><li>Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+structural+divergence+among+Thermus+spp.">Cell wall structural divergence among Thermus spp.</a> FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).</li><li>Torrens, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+peptidoglycans+from+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+recovered+from+chronic+and+acute+infections.">Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).</li><li>Antignac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+structural+analysis+of+the+peptidoglycan+of+the+human+pathogen+Neisseria+meningitidis.">Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).</li><li>De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+composition+of+a+highly+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+strain.+The+role+of+penicillin+binding+protein+2A.">Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muropeptides+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+their+role+as+elicitors+of+&#946;-lactam-antibiotic+resistance.">Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of &#946;-lactam-antibiotic resistance.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).</li><li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+Structure.">Peptidoglycan Structure.</a> Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).</li><li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria.">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li></ol>

Этот протокол описывает способ очистки пептидогликана от бактериальных культур, процесс обнаружения LC-MS и анализа композиции с использованием биоинформатических методов. Здесь мы сосредоточимся на грамотрицательных бактериях, и для анализа грамположительных бактерий потребуется н?...

Пептидогликан (ПГ) является определяющей характеристикой бактерий, которая служит для поддержания морфологии клеток, обеспечивая при этом структурную поддержку белков и других клеточных компонентов 1,2. Основу ПГ составляют чередующиеся β-1,4-связанные N-ацетилмурамовая кислота (MurNAc) и N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)1,2. Каждый MurNAc обладает коротким пептидом, связанным с ᴅ-лактильным остатком, который может быть сшит с соседними пептидами, связанными с дисахаридами (рис. 1A, B). Эта сшивка создает сетчатую структуру, которая охватывает всю клетку и часто называется саккулюсом (рис. 1C). Во время синтеза PG предшественники образуются в цитоплазме и транспортируются через цитоплазматическую мембрану флиппазами. Предшественники впоследствии включаются в зрелый PG ферментами трансгликозилазы и транспептидазы, которые продуцируют гликозидные и пептидные связи соответственно3. Однако после сборки бактерии вырабатывают множество ферментов, которые модифицируют и / или разрушают PG для выполнения ряда клеточных процессов, включая рост и деление. Кроме того, было показано, что различные модификации PG придают адаптации, специфичные для штамма, условий роста и стресса окружающей среды, которые участвуют в клеточной сигнализации, устойчивости к противомикробным препаратам и уклонении от иммунитета хозяина4. В качестве примера распространенной модификацией является добавление ацетильной группы C6 к MurNAc, которая придает резистентность, ограничивая доступ к гликановым β-1,4 связям с ферментами лизоцима, продуцируемыми хозяином, которые разрушают PG 4,5,6. У энтерококков замена концевого ᴅ-Ala пептидной боковой цепи на ᴅ-Lac придает большую устойчивость к противомикробному препарату ванкомицину 7,8.
Общая процедура выделения и очистки PG осталась относительно неизменной с тех пор, как она была описана в 1960-х годах9. Бактериальные мембраны растворяются путем термической обработки SDS с последующим ферментативным удалением связанных белков, гликолипидов и оставшейся ДНК. Очищенный интактный саккулус может быть впоследствии расщеплен на отдельные компоненты путем гидролиза связи β-1,4 между GlcNAc и MurNAc. В результате этого разложения образуются дисахариды GlcNAc-MurNAc с любыми структурными изменениями и/или неповрежденными поперечными связями, которые называются муропептидами (рис. 1B).
Композиционный анализ PG первоначально проводился с помощью жидкостного хроматографического разделения под высоким давлением (ВЭЖХ) для очистки каждого муропептида с последующей ручной идентификацией муропептидов10,11. С тех пор она была заменена тандемной масс-спектрометрией жидкостной хроматографии (LC-MS), которая повышает чувствительность обнаружения и снижает ручную нагрузку на очистку каждого отдельного муропептида. Однако трудоемкий и сложный характер ручной идентификации муропептидов остается ограничивающим фактором, сокращающим количество проводимых исследований. В последние годы, с появлением «омических» технологий, автоматизированная экстракция признаков LC-MS стала мощным инструментом, позволяющим быстро обнаруживать и идентифицировать отдельные соединения в сложных образцах из очень больших наборов данных. После того, как признаки идентифицированы, биоинформационное программное обеспечение статистически сравнивает различия между образцами, используя дифференциальный анализ, выделяя даже минимальные различия между сложным набором данных и отображая их графически для пользователя. Применение программного обеспечения для извлечения признаков для анализа композиции PG только начало изучаться 12,13,14 и связано с биоинформационным анализом 12. В отличие от протеомного анализа, который извлекает выгоду из легкодоступных баз данных белков, которые предсказывают фрагментацию пептидов, что позволяет полностью автоматизировать идентификацию, в настоящее время не существует библиотеки фрагментации для пептидогликомиксов. Тем не менее, выделение признаков может быть связано с известными и прогнозируемыми структурными базами данных для прогнозирования идентификации муропептидов12. Здесь мы представляем подробный протокол использования экстракции признаков на основе LC-MS в сочетании с библиотекой муропептидов для автоматизированной идентификации и биоинформатического дифференциального анализа состава PG (рис. 2).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 &#181;m)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>LC-MS data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating mantle controller, Optichem</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-401-788</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Mantle, 1000mL Hemispherical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CG1000008</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for sacculi purification and MS sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibig condenser, 300MM 24/40,</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CG121805</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>for lyophilization of sacculi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magentic stirrer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>90-691-18</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>LC-MS data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-197-9573</td>
			<td>cleanup of sample before MS injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-000-102</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort clamp</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S02629</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round bottom flask - 1 liter pyrex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-250-084</td>
			<td>for 4% SDS boil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator model 120</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB120</td>
			<td>for sacculi purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator - micro tip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB4422</td>
			<td>for sacculi purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>sacculi wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge bottles, Ti45</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9691797</td>
			<td>sacculi wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water supply</td>
			<td>City</td>
			<td></td>
			<td>for water cooled condenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemdraw</td>
			<td>Cambridgesoft</td>
			<td></td>
			<td>molecular editor for muropeptide fragmentation prediction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Acquisition</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>running QTOF instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Mass Profiler Professional</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>bioinformatic differential analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Personal Compound Database and Library Manager</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>muropeptide m/z MS database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Profinder</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>recursive feature extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Qualitative analysis</td>
			<td>Aglient</td>
			<td></td>
			<td>viewing MS and MS/MS chromatograms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus</td>
			<td>Max Plank Institute of Biochemistry</td>
			<td></td>
			<td>1D annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP168-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27001-500ML-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS tuning mix - HP0321</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1969-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas (&#62;99% purity)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>NI 5.0UH-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S0489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (dibasic)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (monobasic)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stains-all</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-quantitative analysis of peptidoglycan by liquid chromatography mass spectrometry and bioinformatics

Пептидогликан является важным компонентом клеточных стенок бактерий и общей клеточной мишенью для противомикробных препаратов. Хотя аспекты структуры пептидогликана достаточно консервативны для всех бактерий, существуют также значительные различия между грамположительными / отрицательными и между видами. Кроме того, существует множество известных вариаций, модификаций или адаптаций к пептидогликану, которые могут возникать в бактериальном виде в ответ на фазу роста и / или стимулы окружающей среды. Эти вариации создают высокодинамичную структуру, которая, как известно, участвует во многих клеточных функциях, включая рост / деление, устойчивость к антибиотикам и избегание защиты хозяина. Чтобы понять вариации в пептидогликане, общая структура должна быть разбита на составляющие части (известные как муропептиды) и оценена по общему клеточному составу. Peptidoglycomics использует передовую масс-спектрометрию в сочетании с мощным анализом биоинформационных данных для детального изучения состава пептидогликана. Следующий протокол описывает очистку пептидогликана от бактериальных культур, получение данных об интенсивности муропептида с помощью жидкостного хроматографа — масс-спектрометра и дифференциальный анализ состава пептидогликана с использованием биоинформатики.

Повышенная чувствительность обнаружения оборудования MS в сочетании с мощным программным обеспечением для распознавания пиков улучшила способность выделять, контролировать и анализировать составы веществ сложных образцов в мельчайших деталях. Используя эти технологические достиже...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics at JoVE.com

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Этот протокол охватывает подробный анализ состава пептидогликана с использованием жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии в сочетании с передовым программным обеспечением для экстракции признаков и биоинформатического анализа.

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов<em&gt; Золотистый стафилококк</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Идентификация фосфата инозитола или фосфонинозидных взаимодействующих белков по хроматографии Affinity в сочетании с Западной погреловой или масс-спектрометрией

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...