Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (179239) ومؤسسة مكافحة السرطان (Zuerich) ومؤسسة فيلهلم ساندر إلى CL (2019.042.1) ومؤسسة نوفارتيس للأبحاث الطبية والبيولوجية إلى C.L. وعلاوة على ذلك، تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاق منحة ماري سكلودوسكا كوري رقم 765104. نشكر مرفق قياس التدفق الخلوي في بازل على الدعم.

وتم جمع عينات المرضى بعد موافقة مجلس استعراض الأخلاقيات في مستشفيي بازل وتوبينغن الجامعيين.
1. البيوتينيليشن من بروتين الانصهار NKG2D
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة مع مجموعة البيوتينيليشن (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يجب تنفيذ هذه الخ...

<ol>
	<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+cytotoxicity:+how+do+they+pull+the+trigger.">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li><li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+biology:+an+update+and+future+directions.">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Wensveen, F. M., Jelen&#269;i&#263;, V., Poli&#263;, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D:+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness.">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).</li><li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands:+"One+for+All,+All+for+One".">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).</li><li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuity+and+the+single+receptor:+NKG2D.">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li><li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer.">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li><li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D.">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+signaling+by+inhibitory+receptors:+the+NK+cell+paradigm.">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li><li>H&#252;e, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+role+for+NKG2D/MICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease.">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li><li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells.">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium.">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li><li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells.">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li><li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34(-)+fraction.">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li><li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells:+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia.">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li></ol>

هنا نقدم طريقتين تدفق القياسات الخلوية التي يمكن الكشف عن التعبير سطح NKG2DL على خلايا AML الأساسية البشرية. ونبين أن كلا من طرق الكشف يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تلطيخ الأجسام المضادة الأخرى (على سبيل المثال، الكشف عن التعبير CD34). كما يمكن إجراء تلطيخات مماثلة على أنواع الخلايا الأساسية ال?...

خلايا NK هي من المحفزات الهامة للجهاز المناعي الفطري الذي يمكنه التعرف على الخلايا الخبيثة أو الخلايا السليمة المجهدة والقضاء عليها (على سبيل المثال ، عن طريق العدوى الفيروسية) دون تحفيز مستضد سابق1. يتم تنظيم هذه العملية بإحكام من خلال ذخيرة معقدة من مستقبلات تنشيط — مثل مستقبلات السمية الخلوية الطبيعية (NCRs), NKG2D و CD16 — والمستقبلات المثبطة التي يتم تمثيلها إلى حد كبير من قبل مستقبلات قاتلة مثل الغلوبولين المناعي (KIRs)2. ربط KIRs لمضاد الكريات البيض البشري (HLA) جزيئات الفئة الأولى على الخلايا الجسدية يضمن الاعتراف الذاتي وينقل التسامح NK الخلية. من ناحية أخرى، فإن غياب الاعتراف الذاتي وزيادة ربط تنشيط المستقبلات إلى ليغاندس على الخلايا المستهدفة يؤدي إلى إطلاق حبيبات سامة للخلايا مما يؤدي إلى السمية الخلوية بوساطة الخلية NK1. وأخيرا، يمكن للخلايا NK ممارسة السمية الخلوية تعتمد على الأجسام المضادة (ADCC) عن طريق ربط CD16 مستقبلات تنشيط لأهداف التعبير عن الجزء Fc من Ig (FcR)2. وبصرف النظر عن السمية الخلوية المباشرة، يمكن أن تؤدي خلايا NK أيضا إلى إطلاق السيتوكين الذي يسد الفطرية مع الجهاز المناعي التكيفي3.
NKG2D هو مستقبلات تنشيط رئيسية أعرب عنها على NK, NKT, γδ T, والسذاجة CD8 + T الخلايا4 التي تمكن هذه الخلايا المناعية السامة للخلايا للتعرف على وlyse NKG2D ligand (NKG2DL) التعبير عن الخلايا المستهدفة. الخلايا السليمة عادة لا تعبر عن NKG2DL. بدلا من ذلك ، يتم تنظيم التعبير NKG2DL على الخلايا الخبيثة أو المصابة بالفيروس لجعل هذه قابلة للتطهير المناعي5.
عائلة NKG2DL البشرية تضم ثمانية جزيئات معروفة من بينها اثنين من الجزيئات MHC I ذات الصلة بالسلسلة A و B (MICA و MICB6)والبروتينات المرتبطة بالفيروس المضخم للخلايا UL16 1-6 (ULBP1-67). وينظم التعبير عن NKG2DL على النسخ، ما بعد النسخ وكذلك مستويات ما بعد الترجمة8. على هذا النحو، في حين أن التعبير NKG2DL عادة لا يمكن الكشف عنها على سطح الخلايا السليمة، تم الإبلاغ NKG2DL ميرنا9 والتعبير البروتين داخل الخلايا في الأنسجة السليمة. ولا يزال يتعين تحديد الصلة الوظيفية لهذا التعبير والآليات الكامنة وراء أنماط التعبير غير المتكررةهذه 10.
التنظيم الآلي للتعبير NKG2DL في الخلايا السرطانية هو مجال رائع للتحقيق. المسارات المعروفة أن تشارك في الإجهاد الخلوي، على سبيل المثال، مسار الإجهاد الصدمة الحرارية9،أو المسارات المرتبطة تلف الحمض النووي، مثل تترنح telangiectasia تحور (أجهزة الصراف الآلي) وRad3 ذات الصلة (ATR) المسار11،فضلا عن العدوى الفيروسية أو البكتيرية وقد تم ربط مباشرة إلى تحريض التعبير NKG2DL12. ومع ذلك ، حتى لو تم التعبير السطحي عن NKG2DL بشكل فعال ، يمكن فقدان هذا التعبير مرة أخرى من خلال سفك البروتيوليك بوساطة ، وهي آلية مرتبطة بالهروب المناعي والتشخيص السريري الضعيف في بعض أنواع السرطان13.
قد يؤدي غياب سطح الخلية NKG2DL أيضا أدوارا مهمة في المرضى الذين يعانون من مكافحة غسل الأموال. هنا، غالبا ما يحفز العلاج بالعلاج الكيميائي المكثف مغفرة، ولكن الانتكاس غالبا ما يحدث من الخلايا الجذعية اللوكيمية (LSC)، التي تنجو بشكل انتقائي من العلاج الكيميائي وتهرب من الاستجابة المناعية. كما أظهرنا مؤخرا، LSCs، على سبيل المثال، الهروب تحلل الخلية NK عن طريق قمع التعبير سطح NKG2DL14.
عكسيا، يمكن استخدام غياب التعبير NKG2DL السطح كوسيلة لتحديد وعزل السكان الفرعيين المفترضة مثل الجذعية من الخلايا من الخلايا الفرعية اللوكيميا النظير السائبة. هنا، نقدم نهجين تدفق القياسات الخلوية التي يمكن استخدامها للكشف عن التعبير سطح NKG2DL وبالتالي تحديد الخلايا الجذعية السلبية NKG2DL في سرطان الدم وربما أيضا في أنواع السرطان الأخرى: طريقة للتعرف على سطح عموم ليغاند وطريقة تنطوي على تلطيخ مع الأجسام المضادة واحد أو مجمعة التعرف على البروتينات NKG2DL الفردية المعروفة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

داخل نفس المريض ، تبين أن غياب التعبير السطحي NKG2D ligands (NKG2DL) يميز السكان الفرعيين لللوكيميا مع خصائص الخلايا الجذعية (ما يسمى بالخلايا الجذعية اللوكيمية ، LSCs) من الخلايا اللوكيمية النظيرة الأكثر تميزا التي تفتقر إلى إمكانية بدء المرض على الرغم من أنها تحمل طفرات جينية محددة مماثلة لسرطان الدم. NKG2DL هي كيميائيا عالية التنوع MHC فئة أنا مثل الجزيئات الذاتية. الخلايا السليمة في ظروف الهوساتيكي عموما لا تعبر NKG2DL على سطح الخلية. بدلا من ذلك ، يتم حث التعبير عن هذه الليجاند عند التعرض للإجهاد الخلوي (على سبيل المثال ، التحول أو المحفزات المعدية) لتحفيز القضاء على الخلايا التالفة عن طريق التحلل من خلال الخلايا المناعية المعبرة عن مستقبلات NKG2D مثل خلايا القاتل الطبيعي (NK). ومن المثير للاهتمام، يتم قمع التعبير السطحي NKG2DL بشكل انتقائي في الخلايا الفرعية LSC، مما يسمح لهذه الخلايا للتهرب من المراقبة المناعية بوساطة NKG2D. هنا، نقدم تحليلا جنبا إلى جنب لطريقتين مختلفتين لقياس التدفق الخلوي تسمح بالتحقيق في التعبير السطحي NKG2DL على الخلايا السرطانية، أي طريقة تنطوي على التعرف على عموم ليغاند وطريقة تنطوي على تلطيخ مع الأجسام المضادة متعددة ضد ليغاندس واحد. ويمكن استخدام هذه الأساليب لفصل NKG2DL قابلة للحياة السلبية الخلايا الفرعية مع خصائص الخلايا الجذعية السرطان المفترض من NKG2DL إيجابية غير LSC.

يسمح كلا البروتوكولين المعروضين هنا بإثراء AML LSC من خلال التحليلات الخلوية التدفقية باستخدام CD34 ، وهي علامة معروفة ل LSC17، بالاقتران مع التعبير السطحي NKG2DL إما باستخدام التعرف على عموم ليغاند أو تلطيخ مع الأجسام المضادة المجمعة ضد الليجاندات الفردية. في الشكل 1،...

Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

نقدم اثنين من بروتوكولات تلطيخ مختلفة للكشف عن NKG2D ligand (NKG2DL) في عينات سرطان الدم النخاعي الحاد الأولي البشري (AML). ويستند النهج الأول على بروتين الانصهار، وقادرة على التعرف على جميع ligands المعروفة والتي يحتمل أن تكون غير معروفة حتى الآن، في حين أن البروتوكول الثاني يعتمد على إضافة الأجسام المضادة المضادة متعددة NKG2DL.

نهجين تدفق القياسات الخلوية من NKG2D ليغاند الكشف عن السطح لتمييز الخلايا الجذعية من الخلايا الفرعية السائبة في سرطان الدم النخاعي الحاد

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

يعرض هذا البروتوكول طريقتين متميزتين للكشف عن NKG2DLs على سطح خلايا AML. توفر هذه التقنية طريقة تلطيخ سريعة وسهلة الاستخدام للكشف عن جميع NKG2DLs المعروفة وربما غير المعروفة. تسمح هذه الطريقة بفصل الخلايا الجذعية اللوكيمية عن خلايا مكافحة غسل الأموال السائبة ، مما يجعل من الممكن زيادة توصيف هذه الخلايا.ابدأ بإذابة البيوتين وأنابيب بروتين الاندماج NKG2D في درجة حرارة الغرفة. تدور بسرعة أسفل مسحوق FC NKG2D، ثم إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإعادة تشكيل مسحوق ومزيج تماما باستخدام P-1000 micropipette. إضافة 100 ميكرولتر من بروتين الانصهار NKG2DL إلى أنبوب البيوتين للحصول على تركيز نهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر، وخلط الحل جيدا مع P-100 micropipette.لإذابة خلايا AML، قم بإزالة المبرد الذي يحتوي على مكافحة غسل الأموال الأولية من تخزين النيتروجين السائل، ووضعه على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية. تحرك بلطف أنبوب ذهابا وإيابا في الماء، مما يسمح لمحتويات القارورة لتذوب حتى لا يكون هناك سوى الكريستال الجليد الصغيرة اليسار. نقل الخلايا المذابة فورا إلى الوسط الذي يحتوي على أنبوب وشطف القارورة باستخدام ملليلتر واحد من المتوسط.الطرد المركزي الخلايا في 300 مرة G لمدة 10 دقائق والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه. غسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من المتوسط RPMI تحتوي على 10٪ FCS وتكرار الطرد المركزي. إعادة إنفاق بيليه الخلية مع العازلة تلطيخ إلى تركيز النهائي من 0.5 مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر.ثم نقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى ثقافة الخلية 96 جيدا U-أسفل لوحة والطرد المركزي لوحة في 300 مرة G لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه. إعداد مزيج رئيسي من بروتين الاندماج NKG2D البيوتينية بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في حجم نهائي من 50 ميكرولتر لكل بئر مع تركيز NKG2D النهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل بئر.إضافة مزيج رئيسي أعدت وإعادة إنفاق الكريات الخلية مع ماصة 200 ميكرولتر. احتضان لوحة النصوص والطرد المركزي كما هو موضح في المخطوطة النصية. إعداد مزيج رئيسي باستخدام streptavidin PE بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في حجم نهائي من 50 ميكرولتر.إضافة المزيج الرئيسي إلى الخلايا وإعادة إنفاق الكريات مع ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر. بعد الطرد المركزي لوحة والتخلص من supernatant، استخدم 300 ميكرولتر micropipette متعددة القنوات لإعادة إنفاق الكريات الخلية في 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ بالإضافة إلى 7-AAD. ثم تحليل الخلايا باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي.عينات مكافحة غسل الأموال التي تم تحليلها إيجابية لCD34 و NKG2DL ، ولكن توجد أيضا مجموعات فرعية سلبية ، مع أربعة مجموعات مختلفة في المجموع. تبدأ استراتيجية التشتيت النموذجية باختيار السكان الرئيسيين للخلايا عبر FSC و SSC. يتم استبعاد Doublets والخلايا الميتة في تحليل المصب.يتم تعديل البوابات باستخدام ضوابط FMO لضمان تحديد الخلايا الإيجابية بشكل صحيح. يتم تسليط الضوء على كثافة الفلورية للخلايا إيجابية لCD34 مقابل NKG2DL هنا. تظهر خلايا AML الموجبة ل CD34 تعبيرا سطحيا أقل عن NKG2DL ، مما يشير إلى أن تعبير NKG2DL يرتبط بعدم وجود الجذعية.أظهرت ثلاث عينات أولية من مكافحة غسل الأموال 19.8 و49.8 و89.4٪ أحداث إيجابية لتلطيخ بروتين الانصهار مقابل 20.4 و 50.4 و 90.6٪ لتلطيخ الأجسام المضادة ل NKG2DL المجمعة. من ناحية أخرى ، أظهرت تلطيخ واحد ليغاند مجموعة من الأحداث الإيجابية تصل إلى 92 ٪ مع نسب متفاوتة على أساس ligand. عند محاولة هذا الأسلوب، من المهم جدا أن تكون سريعة عند ذوبان الخلايا AML الأساسية، لأنها هشة ويمكن أن يموت بسهولة خلال هذه الخطوة.بعد تنفيذ هذا البروتوكول، يمكن إجراء فرز خلية استنادا إلى إشارة NKG2DL لمزيد من التحقيق في المجموعات السكانية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

بروتوكول شامل للعينة ونخاع العظام عملية قياس الأمراض المتبقية قابلة للقياس والخلايا الجذعية ليوكيميك في سرطان الدم النقوي الحاد

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

إعداد الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية بالطرد المركزي الوترياتيون

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

تقييم الأيضية للخلايا اللوكيميا الرئيسية

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

تدفق سيتوميتريك الكشف عن خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية سرطان الثدي التي شكلت حديثا بعد عكس المبرمج

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

تحليل مقياس التدفق لأنواع الأكسجين التفاعلي الميتوكوندريا في الجذعية المكونة للدم وخلايا البروجينوتريو وابيضاض الدم المدفوع MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

الكشف في الوقت الحقيقي والتقاط المجموعات الفرعية للخلايا الغازية من الثقافات المشتركة

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

زرع داخل الصفاق لتوليد سرطان الدم النخاعي الحاد في الفئران

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

قياس طول التيلومير باستخدام الكشف عن التلألؤ الكيميائي غير المشع

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG  

تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...