Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Swiss National Science Foundation (179239), Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), Wilhelm Sander Foundation til CL (2019.042.1) og Novartis Foundation for medicinsk-biologisk forskning til C.L. Desuden har dette projekt modtaget støtte fra EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. 765104. Vi takker Flow Cytometry-faciliteten i Basel for støtte.

Patientprøver blev indsamlet efter godkendelse fra Ethics Review Board på universitetshospitalerne i Basel og Tuebingen.
1. Biotinylering af NKG2D-fusionsproteinet
BEMÆRK: Dette trin udføres med et biotinyleringssæt (se Materialetabel) i henhold til producentens instruktion. Dette trin i protokollen skal udføres mindst 24 timer før farvningen. Det biotinylerede NKG2D-fusionsprotein skal opbevares ved -20 °C.
<ol><li>Tø både biotin, samt ...

<ol>
	<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+cytotoxicity:+how+do+they+pull+the+trigger.">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li><li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+biology:+an+update+and+future+directions.">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Wensveen, F. M., Jelen&#269;i&#263;, V., Poli&#263;, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D:+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness.">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).</li><li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands:+"One+for+All,+All+for+One".">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).</li><li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuity+and+the+single+receptor:+NKG2D.">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li><li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer.">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li><li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D.">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+signaling+by+inhibitory+receptors:+the+NK+cell+paradigm.">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li><li>H&#252;e, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+role+for+NKG2D/MICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease.">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li><li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells.">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium.">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li><li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells.">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li><li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34(-)+fraction.">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li><li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells:+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia.">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li></ol>

Her præsenterer vi to flow cytometriske metoder, der kan detektere NKG2DL overfladeudtryk på menneskets primære AML-celler. Vi viser, at begge detektionsmetoder kan bruges sammen med andre antistofpletter (f.eks. detektering af CD34-udtryk). Lignende pletter kan også udføres på andre primære celletyper og cellelinjer.
Vi har for nylig vist, at fraværet af NKG2DL på overfladen af AML patient blaster kan berige LSC14. I AML besidder NKG2DL negative, men ikke NKG2...

NK-celler er vigtige effektorer i det medfødte immunsystem, der kan genkende og eliminere ondartede celler eller stressede raske celler (f.eks. ved en virusinfektion) uden forudgående antigenstimulation1. Denne proces er stramt reguleret via et komplekst repertoire af aktiverende receptorer - såsom naturlige cytotoksicitetsreceptorer (NCR'er), NKG2D og CD16 - og hæmmende receptorer, der i vid udstrækning repræsenteres af dræber immunoglobulinlignende receptorer (KIRs)2. Binding af KIR'er til humane leukocytantigen (HLA) klasse I molekyler på somatiske celler sikrer selvgenkendelse og formidler NK celletolerance. På den anden side udløser fraværet af selvgenkendelse og øget binding af aktiverende receptorer til deres ligands på målcellerne frigivelsen af cytotoksiske granulater, der fører til NK cellemedieret cytotoksicitet1. Endelig kan NK-celler udøve antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) ved at binde den aktiverende receptor CD16 til mål, der udtrykker Fc-delen af Ig (FcR)2. Bortset fra direkte cytotoksicitet kan NK-celler også udløse cytokinfrigivelse, der forbinder det medfødte med det adaptive immunsystem3.
NKG2D er en vigtig aktiverende receptor udtrykt på NK, NKT, γδ T og naive CD8+ T-celler4, der gør det muligt for sådanne cytotoksiske immunceller at genkende og lyse NKG2D ligand (NKG2DL), der udtrykker målceller. Raske celler udtrykker normalt ikke NKG2DL. I stedet er NKG2DL-udtryk upreguleret på ondartede eller virusinficerede celler for at gøre disse modtagelige for immunfrigang5.
Den menneskelige NKG2DL-familie består af otte kendte molekyler, blandt hvilke de to MHC I kæderelaterede molekyler A og B (MICA og MICB6) og cytomegalovirus UL16-bindende proteiner 1-6 (ULBP1-67). Udtrykket af NKG2DL er reguleret på transskriptionelle, post-transskriptionelle samt post-translationelle niveauer8. Som sådan, mens NKG2DL udtryk er almindeligt ikke påvises på overfladen af raske celler, NKG2DL mRNA9 og intracellulære protein udtryk blev rapporteret i sundt væv. Den funktionelle relevans af et sådant udtryk og de mekanismer , der ligger til grund for sådanne diskrete udtryksmønstre , mangler stadig at blive defineret10.
Den mekanistiske regulering af NKG2DL-ekspressionen i kræftcellerne er et fascinerende undersøgelsesområde. Veje, der vides at være involveret i enten cellulær stress,f.eks. Men selv om overfladeudtryk af NKG2DL er blevet effektivt induceret, kan dette udtryk gå tabt igen gennem proteolytisk medieret afgivelse, en mekanisme forbundet med immunflugt og dårlig klinisk prognose i nogle kræftformer13.
Fraværet af celleoverfladeNKG2DL kan også spille vigtige roller hos patienter med AML. Her fremkalder behandling med intensiv kemoterapi ofte remission, men tilbagefald opstår ofte fra leukæmiske stamceller (LSC), som selektivt overlever kemoterapier og undgår immunrespons. Som vi for nylig viste, undslipper LSC'er for eksempel NK-celle lysis ved at undertrykke NKG2DL-overfladeudtryk14.
Omvendt kan fraværet af NKG2DL-overfladeudtryk bruges som en metode til at identificere og isolere formodede stamceller fra bulk-modstykke leukemic delpopulationer. Her præsenterer vi to flow cytometriske tilgange, der kan bruges til at detektere NKG2DL overfladeudtryk og derved identificere NKG2DL negative stamceller i leukæmi og måske også i andre kræftformer: En metode til pan-ligand overfladegenkendelse og en metode, der involverer farvning med enkelt eller samlet antistoffer, der genkender individuelle kendte NKG2DL-proteiner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

Inden for samme patient viste fraværet af NKG2D-ligands (NKG2DL) overfladeudtryk at skelne leukæmiske delpopulationer med stamcelleegenskaber (såkaldte leukæmiske stamceller, LSC'er) fra mere differentierede modstykke leukæmiceller, der mangler sygdomsinitieringspotentiale, selvom de bærer lignende leukæmispecifikke genetiske mutationer. NKG2DL er biokemisk meget forskellige MHC klasse I-lignende selvmolekyler. Raske celler i homeostatic betingelser generelt ikke udtrykke NKG2DL på cellens overflade. I stedet fremkaldes ekspressionen af disse ligands ved eksponering for cellulær stress (f.eks. onkogen transformation eller infektiøse stimuli) for at udløse eliminering af beskadigede celler via lysis gennem NKG2D-receptor-udtrykke immunceller som naturlige dræberceller (NK). Interessant nok undertrykkes NKG2DL-overfladeudtryk selektivt i LSC-delpopulationer, så disse celler kan undgå NKG2D-medieret immunovervågning. Her præsenterer vi en side om side-analyse af to forskellige flowcytometrimetoder, der gør det muligt at undersøge NKG2DL-overfladeudtryk på kræftceller, dvs. en metode, der involverer pan-ligand-anerkendelse og en metode, der involverer farvning med flere antistoffer mod enkeltligaler. Disse metoder kan bruges til at adskille levedygtige NKG2DL negative cellulære delpopulationer med formodede kræft stamcelle egenskaber fra NKG2DL positive ikke-LSC.

Begge de protokoller, der præsenteres her, gør det muligt at berige AML LSC ved at flowcytometriske analyser ved hjælp af CD34, en kendt markør for LSC17, i kombination med NKG2DL overfladeudtryk ved enten at udnytte pan-ligand anerkendelse eller farvning med puljede antistoffer mod individuelle ligands. I figur 1viser vi, at de analyserede AML-prøver er positive for CD34 og NKG2DL, men der findes også negative delpopulationer, hvilket fremgår af tilstedeværel...

Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Vi præsenterer to forskellige farvning protokoller for NKG2D ligand (NKG2DL) afsløring i humane primære akut myeloid leukæmi (AML) prøver. Den første tilgang er baseret på et fusionsprotein, der er i stand til at genkende alle kendte og potentielt endnu ukendte ligands, mens den anden protokol er afhængig af tilsætning af flere anti-NKG2DL-antistoffer.

To Flow cytometriske tilgange af NKG2D Ligand Surface Detection at skelne stamceller fra Bulk Subpopulations i akut myeloid leukæmi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Denne protokol viser to forskellige måder at registrere NKG2DLs på overfladen af AML-celler. Teknikken giver en hurtig, brugervenlig farvningsmetode til at registrere alle kendte og muligvis ukendte NKG2DLs. Denne metode giver mulighed for adskillelse af leukæmiske stamceller fra bulk AML-celler, hvilket gør det muligt at karakterisere disse celler yderligere.Begynd med at optø biotin og NKG2D fusion proteinrør ved stuetemperatur. Spin hurtigt NKG2D FC pulveret ned, og tilsæt derefter 500 mikroliter PBS for at rekonstruere pulveret og bland grundigt ved hjælp af en P-1000 mikropipette. Tilsæt 100 mikroliter af NKG2DL fusionsproteinet til et biotinrør for at opnå en endelig koncentration på 10 mikrogram pr. milliliter, og bland opløsningen grundigt med en P-100 mikropipette.For at optø AML-cellerne skal du fjerne kryoformen, der indeholder primær AML, fra væsken nitrogenopbevaring og straks placere den i et 37 grader Celsius vandbad. Flyt forsigtigt røret frem og tilbage i vandet, så indholdet af hætteglasset kan tø op, indtil der kun er en lille iskrystal tilbage. De optøede celler overføres straks til det medium, der indeholder røret, og hætteglasset skylles med en milliliter medium.Centrifuge cellerne ved 300 gange G i 10 minutter og kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten. Cellerne vaskes med fem milliliter RPMI-medium, der indeholder 10%FCS, og centrifugeringen gentages. Genbrug cellepillen med farvningsbuffer til en endelig koncentration på 0,5 gange 10 til de syvende celler pr. milliliter.Derefter overføres 100 mikroliter af celleaffjedringen til en cellekultur 96 godt U-bundplade og centrifuge pladen ved 300 gange G i 10 minutter. Kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten. Forbered en masterblanding af biotinyleret NKG2D-fusionsprotein, så cellerne genbruges i et endeligt volumen på 50 mikroliter pr. brønd med en endelig NKG2D-koncentration på 10 mikrogram pr. milliliter pr. brønd.Tilsæt den forberedte master mix og resuspend celle pellets med en 200 mikroliter pipette. Inkubat og centrifuge pladen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Forbered en master mix ved hjælp af streptavidin PE, så cellerne genbruges i et endeligt volumen på 50 mikroliter.Tilsæt master mix til cellerne og genbruge pellets med en 300 mikroliter multikanal pipette. Efter centrifugering af pladen og kassering af supernatanten skal du bruge en 300 mikroliter multikanalmikropipette til at genbruge cellepillerne i 200 mikroliter farvningsbuffer plus 7-AAD. Analyser derefter cellerne ved hjælp af en flowcytometry-enhed.De analyserede AML-prøver er positive for CD34 og NKG2DL, men der findes også negative delpopulationer med fire forskellige populationer i alt. Den typiske gating strategi starter med udvælgelsen af de vigtigste population af celler via deres FSC og SSC. Doublets og døde celler er udelukket i downstream-analysen.Portene justeres ved hjælp af FMO-kontroller for at sikre korrekt identifikation af positive celler. Fluorescensintensiteten af celler, der er positive for CD34 versus NKG2DL, fremhæves her. AML-celler, der er positive for CD34, viser et lavere overfladeudtryk af NKG2DL, hvilket angiver, at NKG2DL-udtryk er forbundet med manglende stængel.Tre primære AML-prøver demonstrerede 19,8, 49,8 og 89,4% positive hændelser for fusionsproteinbegævningen mod 20,4, 50,4 og 90,6% for den samlede anti-NKG2DL antistofbegæjdning. På den anden side viste enkelt ligand farvning en række positive begivenheder op til 92%, med de procentsatser varierende baseret på ligand. Når du forsøger denne metode, er det meget vigtigt at være hurtig, når du optøer de primære AML-celler, fordi de er skrøbelige og kan dø let i dette trin.Efter at have udført denne protokol kan der udføres en cellesortering baseret på NKG2DL-signalet for yderligere at undersøge populationerne.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokol til prøven og proces knoglemarven til at måle målbare Residual sygdom og Leukemic stamceller i akut Myeloid leukæmi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Forberedelse af primære akut lymfoblastær leukæmiceller i forskellige cellecyklus faser af Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow flowcytometri for at vurdere leukæmi stamceller i primære akut Myeloid leukæmi og Patient-afledt-xenografts, på diagnose og følg op

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering af primære leukæmiceller metaboliske profil

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flow Cytometric påvisning af nydannede brystkræft stamceller-lignende celler efter apoptose tilbageførsel

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Detektion og indfangning i realtid af invasive cellesubpopulationer fra co-kulturer

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Intra-peritoneal transplantation til generering af akut myeloid leukæmi hos mus

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Kvantificering af telomerlængde ved hjælp af ikke-radioaktiv kemiluminescensdetektion

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Forfatter Spotlight: Optimering af ydeevneparametre for TAGGG telomerlængdeanalyse  

Optimering af ydeevneparametre for TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...