Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (179239), de Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), de Wilhelm Sander Foundation aan CL (2019.042.1) en de Novartis Foundation for medical-biological research aan C.L. Bovendien heeft dit project financiering ontvangen van het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 765104. We danken de Flow Cytometry Facility in Basel voor de steun.

Patiëntenmonsters werden verzameld na goedkeuring door de Ethics Review Board van de universitaire ziekenhuizen van Basel en Tuebingen.
1. Biotinylering van het NKG2D fusie-eiwit
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met een biotinyleringskit (zie materiaaltabel)volgens de instructies van de fabrikant. Deze stap van het protocol moet ten minste 24 uur vóór de kleuring worden uitgevoerd. Het biotinylated NKG2D fusie-eiwit moet worden opgeslagen bij ...

<ol>
	<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+cytotoxicity:+how+do+they+pull+the+trigger.">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li><li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+biology:+an+update+and+future+directions.">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Wensveen, F. M., Jelen&#269;i&#263;, V., Poli&#263;, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D:+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness.">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).</li><li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands:+"One+for+All,+All+for+One".">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).</li><li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuity+and+the+single+receptor:+NKG2D.">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li><li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer.">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li><li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D.">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+signaling+by+inhibitory+receptors:+the+NK+cell+paradigm.">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li><li>H&#252;e, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+role+for+NKG2D/MICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease.">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li><li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells.">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium.">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li><li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells.">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li><li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34(-)+fraction.">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li><li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells:+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia.">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li></ol>

Hier presenteren we twee flow cytometrische methoden die NKG2DL-oppervlakteexpressie op menselijke primaire AML-cellen kunnen detecteren. We laten zien dat beide detectiemethoden kunnen worden gebruikt in combinatie met andere antilichaamkleuringen (bijv. het detecteren van CD34-expressie). Vergelijkbare kleuringen kunnen ook worden uitgevoerd op andere primaire celtypen en cellijnen.
We hebben onlangs laten zien dat de afwezigheid van NKG2DL op het oppervlak van AML-patiëntstralen LSC<sup cl...

NK-cellen zijn belangrijke effectoren van het aangeboren immuunsysteem die kwaadaardige cellen of gestreste gezonde cellen (bijv. door een virale infectie) kunnen herkennen en elimineren zonder voorafgaande antigeenstimulatie1. Dit proces wordt strak gereguleerd via een complex repertoire van activerende receptoren (zoals natuurlijke cytotoxiciteitsreceptoren (NVR's), NKG2D en CD16) en remmende receptoren die grotendeels worden vertegenwoordigd door killer immunoglobuline-achtige receptoren (KIR's)2. Binding van KIR's aan humane leukocytenantigeen (HLA) klasse I moleculen op somatische cellen zorgt voor zelfherkenning en brengt NK celtolerantie over. Aan de andere kant veroorzaken afwezigheid van zelfherkenning en verhoogde binding van activerende receptoren aan hun liganden op de doelcellen de afgifte van cytotoxische korrels die leiden tot NK-celgemedieerde cytotoxiciteit1. Ten slotte kunnen NK-cellen antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) uitoefenen door de activerende receptor CD16 te binden aan doelen die het Fc-gedeelte van Ig (FcR)uitdrukken 2. Afgezien van directe cytotoxiciteit kunnen NK-cellen ook cytokine-afgifte activeren die de aangeboren stof overbrugt met het adaptieve immuunsysteem3.
NKG2D is een belangrijke activerende receptor uitgedrukt op NK, NKT, γδ T en naïeve CD8+ T-cellen4 die dergelijke cytotoxische immuuncellen in staat stelt om NKG2D ligand (NKG2DL) te herkennen en te lyseren en doelcellen uit te drukken. Gezonde cellen drukken NKG2DL vaak niet uit. In plaats daarvan wordt de NKG2DL-expressie geherreguleerd op kwaadaardige of met virussen geïnfecteerde cellen om deze vatbaar te maken voor immuunklaring5.
De menselijke NKG2DL-familie bestaat uit acht bekende moleculen waaronder de twee MHC I-ketengerelateerde moleculen A en B (MICA en MICB6) en het cytomegalovirus UL16-bindende eiwitten 1–6 (ULBP1-67). De expressie van NKG2DL is gereguleerd op de transcriptie, post-transcriptionele en de post-translationele niveaus8. Als zodanig, terwijl NKG2DL-expressie meestal niet detecteerbaar is op het oppervlak van gezonde cellen, werden NKG2DL mRNA9 en intracellulaire eiwitexpressie gerapporteerd in gezonde weefsels. De functionele relevantie van een dergelijke expressie en de mechanismen die aan dergelijke discrepante expressiepatronen ten grondslag liggen , moeten nog worden gedefinieerd10.
De mechanistische regulatie van NKG2DL expressie in de kankercellen is een fascinerend onderzoeksgebied. Trajecten waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij cellulaire stress, bijvoorbeeld de hitteschokstressroute9, of DNA-schadegerelateerde paden, zoals de ataxie telangiectasia gemuteerde (ATM) en Rad3-gerelateerde (ATR) route11, evenals virale of bacteriële infecties zijn direct gekoppeld aan de inductie van NKG2DL-expressie12. Echter, zelfs als oppervlakte expressie van NKG2DL effectief is geïnduceerd, kan deze expressie opnieuw verloren gaan door proteolytisch-gemedieerde afwerping, een mechanisme geassocieerd met immuunontsnapping en slechte klinische prognose bij sommige kankers13.
De afwezigheid van celoppervlak NKG2DL kan ook een belangrijke rol spelen bij patiënten met AML. Hier veroorzaakt behandeling met intensieve chemotherapie vaak remissie, maar terugval treedt vaak op door leukemische stamcellen (LSC), die selectief chemotherapieën overleven en immuunrespons ontwijken. Zoals we onlangs hebben laten zien, ontsnappen LSC's bijvoorbeeld aan NK-cellysis door NKG2DL-oppervlakteexpressie14 teonderdrukken.
Omgekeerd kan de afwezigheid van oppervlakte NKG2DL-expressie worden gebruikt als een methode om putatieve stamachtige subpopulaties van cellen te identificeren en viably te isoleren van bulk tegenhanger leukemische subpopulaties. Hier presenteren we twee flow cytometrische benaderingen die kunnen worden gebruikt om NKG2DL-oppervlakteexpressie te detecteren en daarmee NKG2DL-negatieve stamcellen bij leukemie en misschien ook bij andere kankers te identificeren: een methode voor pan-ligand oppervlakteherkenning en een methode waarbij kleuring met enkele of gepoolde antilichamen individuele bekende NKG2DL-eiwitten herkent.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

Bij dezelfde patiënt bleek de afwezigheid van NKG2D liganden (NKG2DL) oppervlakteexpressie leukemische subpopulaties met stamceleigenschappen (zogenaamde leukemische stamcellen, LSC's) te onderscheiden van meer gedifferentieerde tegenhanger leukemische cellen die geen ziekte-initiatiepotentieel hebben, hoewel ze vergelijkbare leukemiespecifieke genetische mutaties dragen. NKG2DL zijn biochemisch zeer diverse MHC klasse I-achtige zelfmoleculen. Gezonde cellen in homeostatische omstandigheden drukken over het algemeen geen NKG2DL uit op het celoppervlak. In plaats daarvan wordt de expressie van deze liganden geïnduceerd bij blootstelling aan cellulaire stress (bijv. oncogene transformatie of infectieuze stimuli) om eliminatie van beschadigde cellen via lysis te activeren via NKG2D-receptor-expresserende immuuncellen zoals nk-cellen (natural killer). Interessant is dat NKG2DL-oppervlakteexpressie selectief wordt onderdrukt in LSC-subpopulaties, waardoor deze cellen NKG2D-gemedieerde immuunbewaking kunnen ontwijken. Hier presenteren we een zij-aan-zij analyse van twee verschillende flowcytometriemethoden die het mogelijk maken om NKG2DL-oppervlakteexpressie op kankercellen te onderzoeken, d.w.z. een methode met pan-ligandherkenning en een methode waarbij meerdere antilichamen tegen enkelvoudige liganden worden gekleurd. Deze methoden kunnen worden gebruikt om levensvatbare NKG2DL-negatieve cellulaire subpopulaties te scheiden met putatieve kankerstamceleigenschappen van NKG2DL-positieve niet-LSC.

Beide hier gepresenteerde protocollen maken de verrijking van AML LSC door flow cytometrische analyses mogelijk met behulp van CD34, een bekende marker van LSC17, in combinatie met NKG2DL-oppervlakteexpressie door gebruik te maken van pan-ligandherkenning of kleuring met gepoolde antilichamen tegen individuele liganden. In figuur 1laten we zien dat de geanalyseerde AML-monsters positief zijn voor CD34 en NKG2DL, maar er bestaan ook negatieve subpopulaties, wat wordt a...

Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

We presenteren twee verschillende kleuringsprotocollen voor NKG2D ligand (NKG2DL) detectie in menselijke primaire acute myeloïde leukemie (AML) monsters. De eerste benadering is gebaseerd op een fusie-eiwit, in staat om alle bekende en potentieel nog onbekende liganden te herkennen, terwijl het tweede protocol afhankelijk is van de toevoeging van meerdere anti-NKG2DL-antilichamen.

Twee flow cytometrische benaderingen van NKG2D Ligand-oppervlaktedetectie om stamcellen te onderscheiden van bulksubpopulaties bij acute myeloïde leukemie

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Dit protocol toont twee verschillende manieren om NKG2DLs op het oppervlak van AML-cellen te detecteren. De techniek biedt een snelle, gebruiksvriendelijke kleurmethode om alle bekende en mogelijk onbekende NKG2DLs te detecteren. Deze methode maakt het mogelijk om leukemische stamcellen te scheiden van bulk AML-cellen, waardoor het mogelijk is om deze cellen verder te karakteriseren.Begin met het ontdooien van de biotine en de NKG2D fusie-eiwitbuizen op kamertemperatuur. Draai snel het NKG2D FC-poeder naar beneden en voeg vervolgens 500 microliters PBS toe om het poeder te reconstrueren en meng grondig met een P-1000 micropipet. Voeg 100 microliter van het NKG2DL-fusie-eiwit toe aan een biotinebuis om een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter te verkrijgen en meng de oplossing grondig met een P-100 micropipet.Om de AML-cellen te ontdooien, verwijdert u de cryovial bevattende primaire AML uit de vloeibare stikstofopslag en plaatst u deze onmiddellijk in een waterbad van 37 graden Celsius. Beweeg de buis voorzichtig heen en weer in het water, zodat de inhoud van de flacon kan ontdooien totdat er nog maar een klein ijskristal over is. Breng de ontdooide cellen onmiddellijk over in het medium met buis en spoel de flacon af met één milliliter medium.Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 maal G en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren. Was de cellen met vijf milliliter RPMI-medium met 10% FCS en herhaal de centrifugeer. Resuspendeer de celkorrel met kleuringsbuffer tot een eindconcentratie van 0,5 maal 10 tot de zevende cel per milliliter.Breng vervolgens 100 microliters van de celsuspensie over naar een celkweek 96 put U-bodemplaat en centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 keer G. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren. Bereid een mastermix van biotinylated NKG2D fusie-eiwit voor, zodat de cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 microliter per put met een uiteindelijke NKG2D-concentratie van 10 microgram per milliliter per put.Voeg de bereide mastermix toe en resuspendeer de celkorrels met een pipet van 200 microliter. Incubeer en centrifugeer de plaat zoals beschreven in het teksthandschrift. Bereid een mastermix voor met streptavidin PE, zodat de cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 microliter.Voeg de mastermix toe aan de cellen en resuspend de pellets met een 300 microliter meerkanaals pipet. Gebruik na het centrifugeren van de plaat en het weggooien van het supernatant een 300 microliter meerkanaals micropipet om de celkorrels opnieuw te gebruiken in 200 microliters kleurbuffer plus 7-AAD. Analyseer vervolgens de cellen met behulp van een flowcytometrieapparaat.De geanalyseerde AML-monsters zijn positief voor CD34 en NKG2DL, maar er bestaan ook negatieve subpopulaties, met in totaal vier verschillende populaties. De typische gatingstrategie begint met de selectie van de belangrijkste populatie cellen via hun FSC en SSC. Doubletten en dode cellen zijn uitgesloten in de downstream analyse.De poorten worden aangepast met behulp van FMO-controles om een goede identificatie van positieve cellen te garanderen. De fluorescentieintensiteiten van cellen die positief zijn voor CD34 versus NKG2DL worden hier benadrukt. AML-cellen die positief zijn voor CD34 vertonen een lagere oppervlakte-expressie van NKG2DL, wat aangeeft dat NKG2DL-expressie geassocieerd is met een gebrek aan steelheid.Drie primaire AML-monsters toonden 19,8, 49,8 en 89,4% positieve voorvallen voor de fusie-eiwitkleuring versus 20,4, 50,4 en 90,6% voor de gepoolde anti-NKG2DL-antilichaamkleuring. Aan de andere kant vertoonde enkele ligandkleuring een reeks positieve gebeurtenissen tot 92%, waarbij de percentages varieerden op basis van de ligand. Bij het proberen van deze methode is het erg belangrijk om snel te zijn bij het ontdooien van de primaire AML-cellen, omdat ze fragiel zijn en gemakkelijk kunnen sterven tijdens deze stap.Na het uitvoeren van dit protocol kan een celsortering op basis van het NKG2DL-signaal worden uitgevoerd om de populaties verder te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Voorbereiding van primaire Acute lymfatische leukemie cellen in verschillende celcyclus fasen door centrifugaal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Stroom cytometrische detectie van nieuwgevormde stamcel-achtige borstkankercellen na Apoptosis omkering

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Intra-peritoneale transplantatie voor het genereren van acute myeloïde leukemie bij muizen

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Kwantificering van de telomeerlengte met behulp van niet-radioactieve chemiluminescentiedetectie

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Auteur in de schijnwerpers: optimalisatie van de prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest  

Optimalisatie van prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...