Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par des subventions du Fonds national suisse de la recherche scientifique (179239), de la Fondation de lutte contre le cancer (Zuerich), de la Fondation Wilhelm Sander au CL (2019.042.1) et de la Fondation Novartis pour la recherche médico-biologique à C.L. En outre, ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 765104. Nous remercions le Centre de cytométrie en flux de Bâle pour son soutien.

Des échantillons de patients ont été prélevés après approbation du Comité d’examen éthique des Hôpitaux universitaires de Bâle et de Tuebingen.
1. Biotinylation de la protéine de fusion NKG2D
REMARQUE: Cette étape est effectuée avec un kit de biotinylation (voir la table des matériaux) conformément aux instructions du fabricant. Cette étape du protocole doit être effectuée au moins 24 h avant la coloration. La protéine de fusion N...

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. 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Ici, nous présentons deux méthodes cytométriques de flux qui peuvent détecter l’expression de surface de NKG2DL sur les cellules primaires humaines d’AML. Nous montrons que les deux méthodes de détection peuvent être utilisées en conjonction avec d’autres colorations d’anticorps (par exemple, la détection de l’expression de CD34). Des taches similaires peuvent également être effectuées sur d’autres types de cellules primaires et lignées cellulaires.
Nous avons récemme...

Les cellules NK sont des effecteurs importants du système immunitaire inné qui peuvent reconnaître et éliminer les cellules malignes ou les cellules saines stressées (par exemple, par une infection virale) sans stimulation antigénique préalable1. Ce processus est étroitement régulé par un répertoire complexe de récepteurs activants ( tels que les récepteurs de cytotoxicité naturelle (RCN), NKG2D et CD16 - et de récepteurs inhibiteurs qui sont largement représentés par des récepteurs tueurs de type immunoglobuline (KIRs)2. La liaison des KIRs aux molécules humaines de classe I de l’antigène leucocytaire (HLA) sur les cellules somatiques assure l’auto-reconnaissance et transmet la tolérance des cellules NK. D’autre part, l’absence d’auto-reconnaissance et la liaison accrue des récepteurs activateurs à leurs ligands sur les cellules cibles déclenchent la libération de granules cytotoxiques conduisant à la cytotoxicité à médiation cellulaire NK1. Enfin, les cellules NK peuvent exercer une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) en liant le récepteur activateur CD16 à des cibles exprimant la partie Fc d’Ig (FcR)2. Outre la cytotoxicité directe, les cellules NK peuvent également déclencher la libération de cytokines reliant l’inné au système immunitaire adaptatif3.
NKG2D est un récepteur activateur majeur exprimé sur les cellules T NK, NKT, γδ T et NAÏves CD8+4 qui permet à ces cellules immunitaires cytotoxiques de reconnaître et de lyser le ligand NKG2D (NKG2DL) exprimant les cellules cibles. Les cellules saines n’expriment généralement pas NKG2DL. Au lieu de cela, l’expression de NKG2DL est régulée à la hausse sur les cellules malignes ou infectées par un virus pour les rendre susceptibles de se prêter à la clairance immunitaire5.
La famille humaine NKG2DL comprend huit molécules connues parmi lesquelles les deux molécules A et B liées à la chaîne du CMH I (MICA et MICB6)et les protéines de liaison au cytomégalovirus UL16 1–6 (ULBP1-67). L’expression de NKG2DL est régulée sur les niveaux transcriptionnel, post-transcriptionnel ainsi que post-traductionnel8. En tant que tel, tandis que l’expression de NKG2DL n’est généralement pas discernable à la surface des cellules saines, NKG2DL ADN messagère9 et expression intracellulaire de protéine ont été rapportés dans les tissus sains. La pertinence fonctionnelle d’une telle expression et les mécanismes sous-jacents à de tels modèles d’expression discordants restent à définir10.
La régulation mécaniste de l’expression de NKG2DL dans les cellules cancéreuses est un domaine fascinant de recherche. Les voies connues pour être impliquées dans le stress cellulaire, par exemple la voie de stress de choc thermique9,ou les voies associées aux dommages à l’ADN, telles que l’ataxie télangiectasie mutée (ATM) et la voie Rad3 connexe (ATR)11,ainsi que les infections virales ou bactériennes ont été directement liées à l’induction de l’expression NKG2DL12. Cependant, même si l’expression de surface de NKG2DL a été effectivement induite, cette expression peut être perdue à nouveau par l’excrétion protéolytique-négociée, un mécanisme associé à l’évasion immunitaire et au mauvais pronostic clinique dans certains cancers13.
L’absence de NKG2DL de surface cellulaire peut également jouer des rôles importants dans les patients avec AML. Ici, le traitement par chimiothérapie intensive induit souvent une rémission, mais la rechute se produit souvent à partir de cellules souches leucémiques (LSC), qui survivent sélectivement aux chimiothérapies et échappent à la réponse immunitaire. Comme nous l’avons récemment montré, les LSC, par exemple, échappent à la lyse des cellules NK en supprimant l’expression de surface NKG2DL14.
Inversement, l’absence d’expression de NKG2DL de surface peut être utilisée comme méthode pour identifier et isoler de manière viative des sous-populations de cellules de type radical putatif de sous-populations leucémiques homologues en vrac. Ici, nous présentons deux approches cytométriques en flux qui peuvent être utilisées pour détecter l’expression de surface de NKG2DL et identifier ainsi les cellules souches négatives de NKG2DL dans la leucémie et peut-être aussi dans d’autres cancers: Une méthode pour la reconnaissance de surface de pan-ligand et une méthode impliquant la coloration avec des anticorps simples ou regroupés reconnaissant des protéines NKG2DL connues individuelles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

Dans le même patient, l’absence de l’expression de surface des ligands de NKG2D (NKG2DL) a été montrée pour distinguer des sous-populations leucémiques avec des propriétés de cellules souches (soi-disant cellules souches leucémiques, LSCs) des cellules leucémiques de contrepartie plus différenciées qui manquent de potentiel d’initiation de la maladie bien qu’elles portent des mutations génétiques spécifiques de leucémie semblables. Les NKG2DL sont des auto-molécules biochimiquement très diversifiées de type CMH de classe I. Les cellules saines dans des conditions homéostatiques n’expriment généralement pas NKG2DL à la surface cellulaire. Au lieu de cela, l’expression de ces ligands est induite lors de l’exposition au stress cellulaire (par exemple, transformation oncogène ou stimuli infectieux) pour déclencher l’élimination des cellules endommagées par la lyse par les cellules immunitaires exprimant les récepteurs NKG2D telles que les cellules tueuses naturelles (NK). Fait intéressant, l’expression de surface de NKG2DL est sélectivement supprimée dans les sous-populations de LSC, permettant à ces cellules d’échapper à la surveillance immunitaire médiée par NKG2D. Ici, nous présentons une analyse côte à côte de deux méthodes différentes de cytometry d’écoulement qui permettent la recherche sur l’expression de surface de NKG2DL sur des cellules cancéreuses c.-à-d., une méthode impliquant l’identification de pan-ligand et une méthode impliquant la souillure avec des anticorps multiples contre des ligands simples. Ces méthodes peuvent être utilisées pour séparer les sous-populations cellulaires négatives viables de NKG2DL ayant des propriétés putatives de cellules souches cancéreuses de NKG2DL non-LSC positives.

Les deux protocoles présentés ici permettent l’enrichissement d’AML LSC par des analyses cytométriques en flux utilisant CD34, un marqueur connu de LSC17,en combinaison avec l’expression de surface de NKG2DL en utilisant la reconnaissance pan-ligand ou la coloration avec des anticorps groupés contre des ligands individuels. Dans la figure 1, nous montrons que les échantillons analysés de laM sont positifs pour CD34 et NKG2DL, mais qu’il existe également...

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Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Nous présentons deux protocoles de souillure différents pour la détection du ligand NKG2D (NKG2DL) dans les échantillons humains primaires de leucémie myéloïde aiguë (AML). La première approche est basée sur une protéine de fusion, capable de reconnaître tous les ligands connus et potentiellement encore inconnus, tandis que le second protocole repose sur l’ajout de plusieurs anticorps anti-NKG2DL.

Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Ce protocole montre deux façons distinctes de détecter NKG2DLs sur la surface des cellules AML. La technique fournit une méthode de coloration rapide et conviviale pour détecter tous les NKG2DLs connus et éventuellement inconnus. Cette méthode permet de séparer les cellules souches leucémiques des cellules de la LAM en vrac, ce qui permet de caractériser davantage ces cellules.Commencez par décongeler la biotine et les tubes protéiques de fusion NKG2D à température ambiante. Faites tourner rapidement la poudre NKG2D FC, puis ajoutez 500 microlitres de PBS pour reconstituer la poudre et mélangez bien à l’aide d’une micropipette P-1000. Ajouter 100 microlitres de la protéine de fusion NKG2DL à un tube de biotine pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre, et bien mélanger la solution avec une micropipette P-100.Pour décongeler les cellules de la LAM, retirez le cryovial contenant la LAM primaire du stockage d’azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Déplacez doucement le tube d’avant en arrière dans l’eau, ce qui permet au contenu du flacon de dégeler jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un petit cristal de glace. Transférer immédiatement les cellules décongelées dans le tube contenant le milieu et rincer le flacon à l’aide d’un millilitre de milieu.Centrifuger les cellules à 300 fois G pendant 10 minutes et jeter le surnageant sans perturber le culot. Laver les cellules avec cinq millilitres de milieu RPMI contenant 10% FCS et répéter la centrifugation. Ressusciter le culot cellulaire avec un tampon de coloration à une concentration finale de 0,5 fois 10 à la septième cellule par millilitre.Puis transférer 100 microlitres de la suspension cellulaire vers une culture cellulaire 96 puits U-bottom plaque et centrifuger la plaque à 300 fois G pendant 10 minutes. Jetez le surnageant sans déranger la pastille. Préparer un mélange maître de protéine de fusion NKG2D biotinylée afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 microlitres par puits avec une concentration finale de NKG2D de 10 microgrammes par millilitre par puits.Ajouter le mélange maître préparé et ressusciter les pastilles de la cellule avec une pipette de 200 microlitres. Incuber et centrifuger la plaque comme décrit dans le manuscrit du texte. Préparer un mélange maître à l’aide de streptavidine PE afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 microlitres.Ajoutez le mélange maître aux cellules et ressuscitez les pastilles avec une pipette multicanal de 300 microlitres. Après avoir centrifugé la plaque et jeté le surnageant, utilisez une micropipette multicanal de 300 microlitres pour ressusciter les pastilles cellulaires dans 200 microlitres de tampon de coloration plus 7-AAD. Ensuite, analysez les cellules à l’aide d’un dispositif de cytométrie en flux.Les échantillons analysés de la LAM sont positifs pour CD34 et NKG2DL, mais il existe également des sous-populations négatives, avec quatre populations différentes au total. La stratégie de gating typique commence par la sélection de la population principale de cellules via leur FSC et SSC. Les doublets et les cellules mortes sont exclus de l’analyse en aval.Les barrières sont ajustées à l’aide de contrôles FMO pour assurer une identification appropriée des cellules positives. Les intensités de fluorescence des cellules positives pour CD34 par rapport à NKG2DL sont mises en évidence ici. Les cellules de la LAM qui sont positives pour CD34 montrent une expression de surface inférieure de NKG2DL, ce qui indique que l’expression de NKG2DL est associée à un manque de stemness.Trois échantillons primaires d’AML ont démontré des événements positifs 19,8, 49,8, et 89,4% pour la souillure de protéine de fusion contre 20,4, 50,4, et 90,6% pour la souillure groupée d’anticorps d’anti-NKG2DL. D’autre part, la souillure simple de ligand a montré une gamme d’événements positifs jusqu’à 92% avec les pourcentages variant basés sur le ligand. Lorsque vous essayez cette méthode, il est très important d’être rapide lors de la décongélation des cellules primaires de la LAM, car elles sont fragiles et peuvent mourir facilement au cours de cette étape.Après avoir effectué ce protocole, un tri de cellules basé sur le signal NKG2DL peut être effectué pour étudier plus en détail les populations.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Analyse cytométrique en flux de biomarqueurs apoptotiques dans les cellules cancéreuses SiHa traitées à l’actinomycine D

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Détection et capture en temps réel de sous-populations cellulaires invasives provenant de co-cultures

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Transplantation intrapéritonéale pour générer une leucémie myéloïde aiguë chez la souris

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...