Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
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Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Schweizerischen Nationalfonds (179239), der Stiftung zur Krebsbekämpfung (Zürich), der Wilhelm Sander Stiftung an CL (2019.042.1) und der Novartis Stiftung für medizinisch-biologische Forschung an C.L. Darüber hinaus wurde dieses Projekt aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 765104 gefördert. Wir danken der Durchflusszytometrie-Anlage in Basel für die Unterstützung.

Patientenproben wurden nach Bewilligung durch die Ethikprüfungskommission der Universitätsspitäler Basel und Tübingen erhoben.
1. Biotinylierung des NKG2D-Fusionsproteins
HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem Biotinylierungskit (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Dieser Schritt des Protokolls muss mindestens 24 Stunden vor der Färbung durchgeführt werden. Das biotinylierte NKG2D-Fusionsprotein sollte be...

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. 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Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Methoden vor, die die NKG2DL-Oberflächenexpression auf menschlichen primären AML-Zellen nachweisen können. Wir zeigen, dass beide Nachweismethoden in Verbindung mit anderen Antikörperfärbungen (z.B. Nachweis der CD34-Expression) eingesetzt werden können. Ähnliche Färbungen können auch an anderen primären Zelltypen und Zelllinien durchgeführt werden.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass das Fehlen von NKG2DL auf der Oberfläche von AML-Patie...

NK-Zellen sind wichtige Effektoren des angeborenen Immunsystems, die bösartige Zellen oder gestresste gesunde Zellen (z.B. durch eine Virusinfektion) ohne vorherige Antigenstimulation erkennen und eliminieren können1. Dieser Prozess wird durch ein komplexes Repertoire an aktivierenden Rezeptoren – wie natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren (NCRs), NKG2D und CD16 – und inhibitorische Rezeptoren, die weitgehend durch Killer-Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren (KIRs) repräsentiert werden, streng reguliert2. Die Bindung von KIRs an humane Leukozytenantigen (HLA)-Klasse-I-Moleküle auf somatischen Zellen gewährleistet die Selbsterkennung und vermittelt NK-Zelltoleranz. Auf der anderen Seite lösen das Fehlen von Selbsterkennung und die erhöhte Bindung von aktivierenden Rezeptoren an ihre Liganden auf den Zielzellen die Freisetzung von zytotoxischen Granula aus, die zu einer NK-zellvermittelten Zytotoxizität führen1. Schließlich können NK-Zellen eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ausüben, indem sie den aktivierenden Rezeptor CD16 an Ziele binden, die den Fc-Anteil von Ig (FcR)2exprimieren. Neben der direkten Zytotoxizität können NK-Zellen auch die Zytokinfreisetzung auslösen, die das Angeborene mit dem adaptiven Immunsystem überbrückt3.
NKG2D ist ein wichtiger aktivierender Rezeptor, der auf NK-, NKT-, γδ T- und naiven CD8+ T-Zellen4 exprimiert wird und es solchen zytotoxischen Immunzellen ermöglicht, NKG2D-Liganden (NKG2DL) exprimierende Zielzellen zu erkennen und zu lysieren. Gesunde Zellen exprimieren normalerweise kein NKG2DL. Stattdessen wird die NKG2DL-Expression auf bösartigen oder virusinfizierten Zellen hochreguliert, um diese für die Immunclearance 5 zuverbessern.
Die humane NKG2DL-Familie umfasst acht bekannte Moleküle, darunter die beiden MHC-I-Kettenmoleküle A und B (MICA und MICB6)und die Cytomegalievirus UL16-bindenden Proteine 1–6 (ULBP1-67). Die Expression von NKG2DL wird auf der transkriptionellen, posttranskriptionellen sowie post-translationalen Ebene8reguliert. Während die NKG2DL-Expression auf der Oberfläche gesunder Zellen normalerweise nicht nachweisbar ist, wurden NKG2DL mRNA9 und intrazelluläre Proteinexpression in gesunden Geweben berichtet. Die funktionelle Relevanz eines solchen Ausdrucks und die Mechanismen, die solchen abweichenden Ausdrucksmustern zugrunde liegen, müssen noch definiert werden10.
Die mechanistische Regulation der NKG2DL-Expression in den Krebszellen ist ein faszinierendes Untersuchungsgebiet. Signalwege, von denen bekannt ist, dass sie entweder an zellulärem Stress beteiligt sind, z. B. der Hitzeschockstressweg9,oder DNA-schadensbedingte Signalwege, wie der Ataxie-Teleangiektasie-mutierte (ATM) und Rad3-assoziierte (ATR) Weg11,sowie virale oder bakterielle Infektionen wurden direkt mit der Induktion der NKG2DL-Expression12in Verbindung gebracht. Aber selbst wenn die Oberflächenexpression von NKG2DL effektiv induziert wurde, kann diese Expression durch proteolytisch vermittelte Ausscheidung wieder verloren gehen, ein Mechanismus, der bei einigen Krebsarten mit Immunentwehung und schlechter klinischer Prognose verbunden ist13.
Das Fehlen von Zelloberflächen-NKG2DL kann auch bei Patienten mit AML eine wichtige Rolle spielen. Hier induziert die Behandlung mit intensiver Chemotherapie oft eine Remission, aber ein Rückfall tritt häufig aus leukämischen Stammzellen (LSC) auf, die Chemotherapien selektiv überleben und der Immunantwort entgehen. Wie wir kürzlich gezeigt haben, entgehen LSCs beispielsweise der NK-Zelllyse, indem sie die NKG2DL-Oberflächenexpression14unterdrücken.
Umgekehrt kann das Fehlen einer Oberflächen-NKG2DL-Expression als Methode verwendet werden, um mutmaßliche stammähnliche Subpopulationen von Zellen aus leukämischen Subpopulationen zu identifizieren und kämisch zu isolieren. Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Ansätze vor, mit denen die NKG2DL-Oberflächenexpression nachgewiesen und damit NKG2DL-negative Stammzellen bei Leukämie und vielleicht auch bei anderen Krebsarten identifiziert werden können: Eine Methode zur Panliganden-Oberflächenerkennung und eine Methode zur Färbung mit einzelnen oder gepoolten Antikörpern, die einzelne bekannte NKG2DL-Proteine erkennen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

Innerhalb desselben Patienten wurde gezeigt, dass das Fehlen einer Oberflächenexpression von NKG2D-Liganden (NKG2DL) leukämische Subpopulationen mit Stammzelleigenschaften (sogenannte leukämische Stammzellen, LSCs) von differenzierteren leukämischen Gegenstückzellen unterscheidet, denen das Krankheitsinitiierungspotenzial fehlt, obwohl sie ähnliche leukämiespezifische genetische Mutationen aufweisen. NKG2DL sind biochemisch sehr vielfältige MHC-Klasse-I-ähnliche Selbstmoleküle. Gesunde Zellen unter homöostatischen Zuständen exprimieren im Allgemeinen kein NKG2DL auf der Zelloberfläche. Stattdessen wird die Expression dieser Liganden bei Exposition gegenüber zellulärem Stress (z. B. onkogene Transformation oder infektiöse Reize) induziert, um die Eliminierung geschädigter Zellen durch Lyse durch NKG2D-Rezeptor-exprimierende Immunzellen wie natürliche Killerzellen (NK) auszulösen. Interessanterweise wird die NKG2DL-Oberflächenexpression in LSC-Subpopulationen selektiv unterdrückt, so dass diese Zellen der NKG2D-vermittelten Immunüberwachung entgehen können. Hier präsentieren wir eine Parallelanalyse von zwei verschiedenen Durchflusszytometrie-Methoden, die die Untersuchung der NKG2DL-Oberflächenexpression auf Krebszellen ermöglichen, d.h. eine Methode mit Panligandenerkennung und eine Methode, bei der mit mehreren Antikörpern gegen einzelne Liganden gefärbt wird. Diese Methoden können verwendet werden, um lebensfähige NKG2DL-negative zelluläre Subpopulationen mit mutmaßlichen Krebsstammzelleigenschaften von NKG2DL-positiven Nicht-LSC-Eigenschaften zu trennen.

Beide hier vorgestellten Protokolle ermöglichen die Anreicherung von AML LSC durch durchflusszytometrische Analysen mit CD34, einem bekannten Marker von LSC17, in Kombination mit NKG2DL-Oberflächenexpression durch entweder unter Verwendung der Panligandenerkennung oder Färbung mit gepoolten Antikörpern gegen einzelne Liganden. In Abbildung 1zeigen wir, dass die analysierten AML-Proben positiv für CD34 und NKG2DL sind, aber auch negative Subpopulationen existieren...

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Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Wir präsentieren zwei verschiedene Färbeprotokolle für den Nachweis von NKG2D-Liganden (NKG2DL) in Humanproben mit primärer akuter myeloischer Leukämie (AML). Der erste Ansatz basiert auf einem Fusionsprotein, das in der Lage ist, alle bekannten und möglicherweise noch unbekannten Liganden zu erkennen, während das zweite Protokoll auf der Zugabe mehrerer Anti-NKG2DL-Antikörper beruht.

Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Dieses Protokoll zeigt zwei verschiedene Möglichkeiten, NKG2DLs auf der Oberfläche von AML-Zellen zu erkennen. Die Technik bietet eine schnelle, benutzerfreundliche Färbemethode, um alle bekannten und möglicherweise unbekannten NKG2DLs zu erkennen. Diese Methode ermöglicht die Trennung von leukämischen Stammzellen von Massen-AML-Zellen, was es ermöglicht, diese Zellen weiter zu charakterisieren.Beginnen Sie mit dem Auftauen des Biotins und der NKG2D-Fusionsproteinröhrchen bei Raumtemperatur. Drehen Sie das NKG2D FC-Pulver schnell herunter, fügen Sie dann 500 Mikroliter PBS hinzu, um das Pulver zu rekonstituieren, und mischen Sie es gründlich mit einer P-1000-Mikropipette. Fügen Sie 100 Mikroliter des NKG2DL-Fusionsproteins in eine Biotinröhre hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, und mischen Sie die Lösung gründlich mit einer P-100-Mikropipette.Um die AML-Zellen aufzutauen, entfernen Sie das kryoviale primäre AML aus dem Flüssigstickstoffspeicher und legen Sie es sofort in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig im Wasser hin und her, damit der Inhalt der Durchstechflasche auftauen kann, bis nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist. Geben Sie die aufgetauten Zellen sofort in das Medium, das das Röhrchen enthält, und spülen Sie die Durchstechflasche mit einem Milliliter Medium aus.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G für 10 Minuten und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Das Zellpellet mit Färbepuffer wird auf eine Endkonzentration von 0,5 mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter resuspendiert.Dann 100 Mikroliter der Zellsuspension auf eine Zellkultur 96 Well U-Bodenplatte geben und die Platte bei 300 mal G für 10 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Bereiten Sie eine Mastermischung aus biotinyliertem NKG2D-Fusionsprotein vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern pro Vertiefung mit einer endgültigen NKG2D-Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter pro Vertiefung resuspendiert werden.Fügen Sie die vorbereitete Mastermischung hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 200 Mikroliter Pipette. Inkubieren und zentrifugieren Sie die Platte wie im Textmanuskript beschrieben. Bereiten Sie eine Mastermischung mit Streptavidin PE vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern resuspendiert werden.Fügen Sie die Mastermischung zu den Zellen hinzu und resuspendieren Sie die Pellets mit einer 300 Mikroliter Mehrkanalpipette. Nachdem Sie die Platte zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, verwenden Sie eine 300-Mikroliter-Mehrkanal-Mikropipette, um die Zellpellets in 200 Mikrolitern Färbepuffer plus 7-AAD wieder aufzubesiedeln. Dann analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät.Die analysierten AML-Proben sind positiv für CD34 und NKG2DL, aber es gibt auch negative Subpopulationen mit insgesamt vier verschiedenen Populationen. Die typische Gating-Strategie beginnt mit der Auswahl der Hauptpopulation von Zellen über ihren FSC und SSC. Dubstoppeln und abgestorbene Zellen werden in der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen.Die Tore werden mit FMO-Kontrollen eingestellt, um eine ordnungsgemäße Identifizierung positiver Zellen zu gewährleisten. Die Fluoreszenzdichten von Zellen, die für CD34 im Vergleich zu NKG2DL positiv sind, werden hier hervorgehoben. AML-Zellen, die positiv für CD34 sind, zeigen eine geringere Oberflächenexpression von NKG2DL, was darauf hindeutet, dass die NKG2DL-Expression mit einem Mangel an Stammigkeit verbunden ist.Drei primäre AML-Proben zeigten 19,8, 49,8 und 89,4% positive Ereignisse für die Fusionsproteinfärbung gegenüber 20,4, 50,4 und 90,6% für die gepoolte Anti-NKG2DL-Antikörperfärbung. Auf der anderen Seite zeigte die Einzelligandenfärbung eine Reihe positiver Ereignisse von bis zu 92%, wobei die Prozentsätze je nach Liganden variierten. Bei diesem Versuch ist es sehr wichtig, beim Auftauen der primären AML-Zellen schnell zu sein, da sie zerbrechlich sind und während dieses Schritts leicht absterben können.Nach der Durchführung dieses Protokolls kann eine Zellsortierung basierend auf dem NKG2DL-Signal durchgeführt werden, um die Populationen weiter zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Forschung

Krebsforschung

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Intraperitoneale Transplantation zur Erzeugung akuter myeloischer Leukämie bei Mäusen

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Quantifizierung der Telomerlänge mittels nicht-radioaktiver Chemilumineszenzdetektion

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Autor im Rampenlicht: Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays  

Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...