Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדע השוויצרית (179239), הקרן למאבק בסרטן (Zuerich), קרן וילהלם סנדר ל- CL (2019.042.1) וקרן נוברטיס למחקר רפואי-ביולוגי ל- C.L. יתר על כן, פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי Skłodowska-Curie מס '765104. אנו מודים למתקן ציטומטריית הזרימה בבאזל על התמיכה.

דגימות מטופלים נאספו לאחר אישור הוועדה לבדיקת אתיקה של בתי החולים האוניברסיטאיים באזל וטובינגן.
1. ביו-טינילציה של חלבון ההיתוך NKG2D
הערה: שלב זה מבוצע עם ערכת ביוטינילציה (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראת היצרן. שלב זה של הפרוטוקול חייב להתבצע לפחות 24 שעו?...

<ol>
	<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+cytotoxicity:+how+do+they+pull+the+trigger.">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li><li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+biology:+an+update+and+future+directions.">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Wensveen, F. M., Jelen&#269;i&#263;, V., Poli&#263;, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D:+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness.">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).</li><li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands:+"One+for+All,+All+for+One".">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).</li><li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuity+and+the+single+receptor:+NKG2D.">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li><li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer.">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li><li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D.">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+signaling+by+inhibitory+receptors:+the+NK+cell+paradigm.">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li><li>H&#252;e, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+role+for+NKG2D/MICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease.">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li><li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells.">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium.">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li><li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells.">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li><li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34(-)+fraction.">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li><li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells:+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia.">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li></ol>

כאן אנו מציגים שתי שיטות ציטומטריות זרימה שיכולות לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL על תאי AML ראשיים אנושיים. אנו מראים כי ניתן להשתמש בשתי שיטות הזיהוי בשילוב עם כתמי נוגדנים אחרים (למשל, זיהוי ביטוי CD34). כתמים דומים עשויים להתבצע גם בסוגי תאים ראשיים אחרים וקווי תאים.
לאחרונה הראינו ?...

תאי NK הם משפיעים חשובים של מערכת החיסון המולדת שיכולים לזהות ולחסל תאים ממאירים או תאים בריאים לחוצים (למשל, על ידי זיהום ויראלי) ללא גירוי אנטיגן קודם1. תהליך זה מוסדר היטב באמצעות רפרטואר מורכב של הפעלת קולטנים - כגון קולטני ציטוטוקסיות טבעיים (NCRs), NKG2D ו- CD16 - וקולטנים מעכבים המיוצגים במידה רבה על ידי קולטנים דמויי אימונוגלובולין רוצח (KIRs)2. קשירת KIRs למולקולות אנטיגן מסוג לויקוציטים אנושי (HLA) מסוג I על תאים סומטיים מבטיחה הכרה עצמית ומעבירה סובלנות לתאי NK. מצד שני, היעדר הכרה עצמית וקשירה מוגברת של הפעלת קולטנים לליגנדים שלהם על תאי היעד מפעילים את שחרורם של גרגירים ציטוטוקסיים המובילים לציטוקסיות בתיווך תא NK1. לבסוף, תאי NK יכולים להפעיל ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) על ידי כריכה של קולטן הפעלת CD16 ליעדים המבטאים את החלק Fc של Ig (FcR)2. מלבד ציטוטוקסיות ישירה, תאי NK יכולים גם לעורר שחרור ציטוקינים המגשר בין המולדת למערכת החיסון האדפטיבית3.
NKG2D הוא קולטן הפעלה מרכזי המתבטא ב- NK, NKT, γδ T, ותאי CD8 + T נאיביים4 המאפשרים לתאי חיסון ציטוקסיים כאלה לזהות וליזה ליגנד NKG2D (NKG2DL) המבטאים תאי יעד. תאים בריאים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL. במקום זאת, ביטוי NKG2DL הוא upregulated על תאים ממאירים או נגועים בווירוס כדי להפוך אותם נוחים לאישור מערכת החיסון5.
משפחת NKG2DL האנושית כוללת שמונה מולקולות ידועות ביניהן שתי המולקולות הקשורות לשרשרת MHC I A ו- B (MICA ו- MICB6) וחלבוני cytomegalovirus UL16 מחייבים 1-6 (ULBP1-67). הביטוי של NKG2DL מוסדר על תמלול, לאחר תמלול, כמו גם את הרמות שלאחר התרגום8. ככזה, בעוד ביטוי NKG2DL הוא בדרך כלל לא ניתן לזהות על פני השטח של תאים בריאים, NKG2DL mRNA9 וביטוי חלבון תאי דווחו ברקמות בריאות. הרלוונטיות התפקודית של ביטוי כזה והמנגנונים שבביד דפוסי ביטוי אי התאמה כאלה נותרים מוגדרים10.
הרגולציה המכניסטית של ביטוי NKG2DL בתאי הסרטן היא תחום חקירה מרתק. מסלולים ידועים להיות מעורבים או מתח תאי, למשל, מסלול הלחץ הלם חום9, או נתיבים הקשורים נזק DNA, כגון אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM) ו Rad3 הקשורים (ATR) מסלול11, כמו גם זיהומים ויראליים או חיידקיים קושרו ישירות אינדוקציה של ביטוי NKG2DL12. עם זאת, גם אם ביטוי פני השטח של NKG2DL הושרה ביעילות, ביטוי זה יכול ללכת לאיבוד שוב באמצעות שפיכה בתיווך פרוטאוליטי, מנגנון הקשורים לבריחה חיסונית ופרוגנוזה קלינית לקויה בכמה סוגי סרטן13.
היעדר משטח התא NKG2DL עשוי גם לשחק תפקידים חשובים בחולים עם AML. כאן, טיפול עם כימותרפיה אינטנסיבית לעתים קרובות גורם הפוגה, אבל הישנות מתרחשת לעתים קרובות מתאי גזע לויקמיים (LSC), אשר באופן סלקטיבי לשרוד כימותרפיה ולהתחמק תגובה חיסונית. כפי שהראינו לאחרונה, LSCs, למשל, לברוח תמוגה תא NK על ידי דיכוי ביטוי פני השטח NKG2DL14.
הפוך, היעדר ביטוי NKG2DL משטח יכול לשמש כשיטה לזהות ולבודד באופן מעשי תת-אוכלוסין דמוי גזע putative של תאים מתת אוכלוסין לויקמי מקביל בתפזורת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ציטומטריות זרימה שניתן להשתמש בהן כדי לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL ובכך לזהות תאי גזע שליליים NKG2DL בלוקמיה ואולי גם בסרטנים אחרים: שיטה לזיהוי משטח פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים בנוגדנים בודדים או מרופדים המזהים חלבוני NKG2DL ידועים בודדים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

בתוך אותו חולה, היעדר ליגנדים NKG2D (NKG2DL) ביטוי פני השטח הוכח להבחין בין תת אוכלוסין לוקמי עם תכונות תאי גזע (מה שנקרא תאי גזע לויקמיים, LSCs) מתאים לויקמיים עמיתים מובחנים יותר חסרי פוטנציאל חניכת מחלות למרות שהם נושאים מוטציות גנטיות ספציפיות לוקמיה דומות. NKG2DL הן ביוכימיות מגוונות מאוד MHC בכיתה I כמו מולקולות עצמיות. תאים בריאים בתנאים הומיאוסטטיים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL על פני התא. במקום זאת, ביטוי של ליגנדים אלה מושרה עם חשיפה ללחץ תאי (למשל, טרנספורמציה אונקוגנית או גירויים זיהומיים) כדי לעורר חיסול של תאים פגומים באמצעות תמוגה באמצעות תאי מערכת החיסון קולטן NKG2D כגון תאי רוצח טבעי (NK). מעניין, ביטוי פני השטח NKG2DL מודחק באופן סלקטיבי בתת-אוכלוסין LSC, ומאפשר לתאים אלה להתחמק ממעקב חיסוני בתיווך NKG2D. כאן, אנו מציגים ניתוח זה לצד זה של שתי שיטות ציטומטריית זרימה שונות המאפשרות חקירה של ביטוי פני השטח NKG2DL על תאים סרטניים כלומר, שיטה הכוללת זיהוי פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים עם נוגדנים מרובים נגד ליגנדים בודדים. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להפריד תת-אוכלוסין תאיים שלילי NKG2DL קיימא עם תכונות תאי גזע סרטן putative מ NKG2DL חיובי שאינו LSC.

שני הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים העשרה של AML LSC על ידי ניתוחים ציטומטריים זרימה באמצעות CD34, סמן ידוע של LSC17, בשילוב עם ביטוי פני השטח NKG2DL על ידי שימוש בזיהוי פאן-ליגנד או כתמים עם נוגדנים משולבים נגד ליגנדים בודדים. באיור 1, אנו מראים כי דגימות AML המנותחות חיוב?...

Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

אנו מציגים שני פרוטוקולי הכתמה שונים עבור NKG2D ליגנד (NKG2DL) זיהוי בלוקמיה מיאלואידית חריפה אנושית (AML) דגימות. הגישה הראשונה מבוססת על חלבון היתוך, המסוגל לזהות את כל הליבנדים הידועים ואולי עדיין לא ידועים, בעוד הפרוטוקול השני מסתמך על תוספת של נוגדנים מרובים נגד NKG2DL.

שתי גישות ציטומטריות זרימה של גילוי משטח ליגנד NKG2D כדי להבחין בין תאי גזע לבין תת אוכלוסין בתפזורת בלוקמיה מיאלואידית חריפה

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

פרוטוקול זה מציג שתי דרכים נפרדות לזיהוי NKG2DLs על פני השטח של תאי AML. הטכניקה מספקת שיטת הכתמים מהירה וידידותית למשתמש כדי לזהות את כל NKG2DLs הידועים ואולי לא ידועים. שיטה זו מאפשרת הפרדה של תאי גזע לויקמיים מתאי AML בתפזורת, מה שמאפשר לאפיין תאים אלה עוד יותר.התחל על ידי הפשרת ביוטין ואת צינורות חלבון היתוך NKG2D בטמפרטורת החדר. סובב במהירות את אבקת NKG2D FC, ולאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטרים של PBS כדי לשחזר את האבקה ולערבב ביסודיות באמצעות מיקרופיט P-1000. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חלבון ההיתוך NKG2DL לצינור ביוטין כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר, וערבבו את התמיסה ביסודיות עם מיקרופיפט P-100.כדי להפשיר את תאי AML, להסיר את cryovial המכיל AML ראשוני מאחסון חנקן נוזלי, ומיד למקם אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מעבירים בעדינות את הצינור קדימה ואחורה במים, ומאפשרים לתוכן המצוין להפשיר עד שנותר רק גבישי קרח קטן. מעבירים מיד את התאים המופשרים לצינור הבינוני המכיל ושוטפים את הנקינה באמצעות מיליליטר אחד של בינוני.צנטריפוגות התאים ב 300 פעמים G במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור. לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של RPMI בינוני המכיל 10%FCS ולחזור על צנטריפוגה. resuspend גלולה התא עם חוצץ כתמים לריכוז הסופי של 0.5 פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר.לאחר מכן להעביר 100 microliters של השעיית התא לתרבות תא 96 היטב צלחת U-התחתון וצנטריפוגה הצלחת ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור. הכן תערובת ראשית של חלבון היתוך ביוטינילציה NKG2D כך שהתאים יתמכו מחדש בנפח סופי של 50 מיקרוליטרים לבאר עם ריכוז NKG2D סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לבאר.מוסיפים את תערובת המאסטר המוכנה ומוסיפים מחדש את כדורי התא עם פיפטה של 200 מיקרוליטרים. דגירה וצנטריפוגות הלוח כמתואר בכתב היד של הטקסט. הכן תערובת מאסטר באמצעות Streptavidin PE, כך התאים הם resuspended בנפח סופי של 50 microliters.מוסיפים את תערובת האב לתאים ומערבבים מחדש את הכדורים עם פיפטה רב-ערוצית של 300 מיקרוליטרים. לאחר צנטריפוגה של הצלחת והשלכת supernatant, להשתמש micropipette רב ערוצי 300 microliter כדי resuspend כדורי התא ב 200 microliters של חוצץ כתמים בתוספת 7-AAD. לאחר מכן נתח את התאים באמצעות התקן ציטומטריית זרימה.דגימות AML שנותחו הן חיוביות עבור CD34 ו NKG2DL, אבל אוכלוסיות משנה שליליות קיימות גם, עם ארבע אוכלוסיות שונות בסך הכל. אסטרטגיית הגטינג הטיפוסית מתחילה בבחירת האוכלוסייה העיקרית של תאים באמצעות ה- FSC וה- SSC שלהם. מכפילים ותאים מתים אינם נכללים בניתוח במורד הזרם.השערים מותאמים באמצעות פקדי FMO כדי להבטיח זיהוי נכון של תאים חיוביים. עוצמות הפלואורסצנטיות של תאים חיוביים עבור CD34 לעומת NKG2DL מודגשות כאן. תאי AML חיוביים עבור CD34 מציגים ביטוי משטח נמוך יותר של NKG2DL, המציין כי ביטוי NKG2DL משויך לחוסר גזענות.שלוש דגימות AML עיקריות הדגימו 19.8, 49.8 ו-89.4% אירועים חיוביים עבור כתמי חלבון ההיתוך לעומת 20.4, 50.4 ו-90.6% עבור כתמי נוגדן NKG2DL. מצד שני, כתמי ליגנד יחיד הראו מגוון של אירועים חיוביים עד 92%עם האחוזים משתנים על בסיס ליגנד. כאשר מנסים שיטה זו, חשוב מאוד להיות מהיר בעת הפשרת תאי AML העיקריים, כי הם שבירים יכול למות בקלות במהלך שלב זה.לאחר ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לבצע מיון תאים המבוסס על אות NKG2DL כדי להמשיך לחקור את האוכלוסיות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

זיהוי ולכידה בזמן אמת של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות מתרביות משותפות

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

השתלה תוך צפקית ליצירת לוקמיה מיאלואידית חריפה בעכברים

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

כימות אורך הטלומרים באמצעות זיהוי כימילומינסנציה לא רדיואקטיבית

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

מחבר זרקור: אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG  

אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...