Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

इस अध्ययन को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (179239), कैंसर के खिलाफ लड़ाई के लिए फाउंडेशन (Zuerich), विल्हेम सैंडर फाउंडेशन सीएल (2019.042.1) और मेडिकल-बायोलॉजिकल रिसर्च के लिए नोवार्टिस फाउंडेशन से सी.एल. इसके अलावा, इस परियोजना को मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 765104 के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है । हम समर्थन के लिए बेसल में फ्लो साइटोमेट्री सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं ।

बेसल और Tuebingen के विश्वविद्यालय अस्पतालों के नैतिकता की समीक्षा बोर्ड से अनुमोदन के बाद रोगी नमूने एकत्र किए गए ।
1. NKG2D फ्यूजन प्रोटीन का बायोटिनाइलेशन
नोट: यह कदम निर्माता के निर्देश ?...

<ol>
	<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+cytotoxicity:+how+do+they+pull+the+trigger.">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li><li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+biology:+an+update+and+future+directions.">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Wensveen, F. M., Jelen&#269;i&#263;, V., Poli&#263;, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D:+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness.">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).</li><li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands:+"One+for+All,+All+for+One".">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).</li><li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuity+and+the+single+receptor:+NKG2D.">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li><li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer.">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li><li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D.">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+signaling+by+inhibitory+receptors:+the+NK+cell+paradigm.">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li><li>H&#252;e, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+role+for+NKG2D/MICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease.">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li><li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells.">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium.">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li><li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells.">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li><li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34(-)+fraction.">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li><li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells:+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia.">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li></ol>

यहां हम दो फ्लो साइटोमेट्रिक तरीके पेश करते हैं जो मानव प्राथमिक एएमएल कोशिकाओं पर NKG2DL सतह अभिव्यक्ति का पता लगा सकते हैं। हम बताते हैं कि दोनों डिटेक्शन विधियों का उपयोग अन्य एंटीबॉडी स्टेनिंग (उदाहर?...

एनके कोशिकाएं जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण प्रभावक हैं जो पूर्व एंटीजन उत्तेजना1के बिना घातक कोशिकाओं को पहचान और समाप्त कर सकती हैं या स्वस्थ कोशिकाओं (जैसे, वायरल संक्रमण से) पर बल दिया जा सकता है। इस प्रक्रिया को रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के जटिल प्रदर्शनों की सूची के माध्यम से कसकर विनियमित किया जाता है-जैसे प्राकृतिक साइटोटॉक्सीसिटी रिसेप्टर्स (एनसीआरएस), एनके2डी और सीडी 16-और निरोधात्मक रिसेप्टर्स जो काफी हद तक किलर इम्यूनोग्लोबुलिन जैसे रिसेप्टर्स (KIRs)2द्वारा प्रतिनिधित्व करते हैं । दैहिक कोशिकाओं पर मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) वर्ग I अणुओं के लिए KIRs का बंधन आत्म-मान्यता सुनिश्चित करता है और एनके सेल सहिष्णुता को व्यक्त करता है। दूसरी ओर, आत्म-मान्यता की अनुपस्थिति और लक्ष्य कोशिकाओं पर अपने लिगामेंट्स को सक्रिय करने के लिए रिसेप्टर्स को सक्रिय करने की बाध्यकारी वृद्धि से साइटोटॉक्सिक कणिकाओं की रिहाई को ट्रिगर किया जाता है जिससे एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी1होता है। अंत में, एनके कोशिकाएं आईजी (एफसीआर)2के एफसी हिस्से को व्यक्त करने के लक्ष्यों को सक्रिय रिसेप्टर सीडी 16 के बाध्यकारी द्वारा एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिटी (एडीसीसी) लागू कर सकती हैं। प्रत्यक्ष साइटोटॉक्सिकिटी के अलावा, एनके कोशिकाएं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली3के साथ जन्मजात को पाटने के लिए साइटोकिन रिलीज को भी ट्रिगर कर सकती हैं।
NKG2D एनके, एनकेटी, γδ टी और भोली सीडी 8 + टी कोशिकाओं पर व्यक्त किया गया एक प्रमुख सक्रिय रिसेप्टर है जो इसतरह के साइटोटॉक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लक्षित कोशिकाओं को व्यक्त करने और NKG2D ligand (NKG2DL) को पहचानने और lyse करने में सक्षम बनाता है। स्वस्थ कोशिकाएं आमतौर पर NKG2DL व्यक्त नहीं करती हैं। इसके बजाय, NKG2DL अभिव्यक्ति घातक या वायरस संक्रमित कोशिकाओं पर विनियमित करने के लिए इन प्रतिरक्षा निकासी5के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए है ।
मानव NKG2DL परिवार में आठ ज्ञात अणु शामिल हैं जिनमें से दो MHC I श्रृंखला से संबंधित अणु ए और बी (MICA और MICB6)और साइटोमेगालोवायरस UL16-बाध्यकारी प्रोटीन 1-6 (ULBP1-67)शामिल हैं । NKG2DL की अभिव्यक्ति ट्रांसक्रिप्शनल, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल के साथ-साथ पोस्ट-ट्रांसलेशनल स्तर8पर विनियमित है। जैसे, जबकि NKG2DL अभिव्यक्ति आमतौर पर स्वस्थ कोशिकाओं की सतह पर पता लगाने योग्य नहीं है, NKG2DL mRNA9 और इंट्रासेलुलर प्रोटीन अभिव्यक्ति स्वस्थ ऊतकों में सूचित किया गया । ऐसी अभिव्यक्ति की कार्यात्मक प्रासंगिकता और ऐसे विकृत अभिव्यक्ति पैटर्न में अंतर्निहित तंत्र कोपरिभाषितकिया जाना बाकी है ।
कैंसर कोशिकाओं में NKG2DL अभिव्यक्ति का यंत्रवादी नियमन जांच का एक आकर्षक क्षेत्र है । या तो सेलुलर तनाव में शामिल होने के लिए जाना जाता रास्ते, उदाहरण के लिए, गर्मी सदमे तनाव मार्ग9,या डीएनए क्षति से जुड़े रास्ते, जैसे ataxia telangiectasia उत्परिवर्तित (ATM) और Rad3 संबंधित (एटीआर) मार्ग11,साथ ही वायरल या जीवाणु संक्रमण सीधे NKG2DL अभिव्यक्ति12के शामिल होने से जुड़ा हुआ है । हालांकि, भले ही NKG2DL की सतह अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से प्रेरित किया गया है, इस अभिव्यक्ति को प्रोटियोलिटिक-मध्यस्थता शेडिंग के माध्यम से फिर से खोया जा सकता है, कुछ कैंसर13में प्रतिरक्षा भागने और खराब नैदानिक पूर्वानुमान से जुड़े तंत्र।
सेल सरफेस एनके2डीएल की अनुपस्थिति भी एएमएल के साथ रोगियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। यहां, गहन कीमोथेरेपी के साथ उपचार अक्सर छूट लाती है, लेकिन पतन अक्सर ल्यूकेमिक स्टेम सेल (एलएससी) से होता है, जो चुनिंदा रूप से कीमोथेरपी से बचते हैं और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचते हैं। जैसा कि हमने हाल ही में दिखाया, उदाहरण के लिए, एलएससी, एनके 2डीएल सतह अभिव्यक्ति14को दबाकर एनके सेल लाइसिस से बच गया।
इसके विपरीत, सतह NKG2DL अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति को थोक समकक्ष ल्यूकेमिक उप-आबादी से कोशिकाओं की ख्यात स्टेम जैसी उप-आबादी की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां, हम दो प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण पेश करते हैं जिनका उपयोग NKG2DL सतह अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जा सकता है और इस तरह ल्यूकेमिया में NKG2DL नकारात्मक स्टेम कोशिकाओं की पहचान करता है और शायद अन्य कैंसर में भी: पैन-लिगांड सतह मान्यता के लिए एक विधि और व्यक्तिगत ज्ञात NKG2DL प्रोटीन को पहचानने वाले एकल या पूल किए गए एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने वाली विधि।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

एक ही रोगी के भीतर, NKG2D ligands (NKG2DL) सतह अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति को स्टेम सेल गुणों (तथाकथित ल्यूकेमिक स्टेम सेल, एलएससी) के साथ ल्यूकेमिक सबपॉलेशन को अलग करने के लिए दिखाया गया था, जो अधिक विभेदित समकक्ष ल्यूकेमिक कोशिकाओं से होता है, जिसमें रोग दीक्षा क्षमता की कमी होती है, हालांकि वे समान ल्यूकेमिया विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तन ले जाते हैं। एनकेजी2डीएल जैव रासायनिक रूप से अत्यधिक विविध एमएचसी वर्ग I-जैसे आत्म-अणु हैं। होम्योस्टेटिक स्थितियों में स्वस्थ कोशिकाएं आमतौर पर कोशिका की सतह पर NKG2DL व्यक्त नहीं करती हैं। इसके बजाय, इन लिगांड की अभिव्यक्ति सेलुलर तनाव (जैसे, ऑन्कोजेनिक परिवर्तन या संक्रामक उत्तेजनाओं) के संपर्क में आने पर प्रेरित होती है ताकि एनकेजी2डी-रिसेप्टर-प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को व्यक्त करने के माध्यम से लाइसिस के माध्यम से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के उन्मूलन को ट्रिगर किया जा सके। दिलचस्प बात यह है कि एनकेजी2डीएल सतह अभिव्यक्ति को एलएससी उपआबादी में चुनिंदा रूप से दबा दिया जाता है, जिससे इन कोशिकाओं को NKG2D-मध्यस्थता प्रतिरक्षा निगरानी से बचने की अनुमति होती है। यहां, हम दो अलग-अलग प्रवाह साइटोमेट्री विधियों का एक साथ-साथ विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं जो कैंसर कोशिकाओं पर NKG2DL सतह अभिव्यक्ति की जांच की अनुमति देते हैं यानी, पैन-लिगांड मान्यता और एकल लिगांड के खिलाफ कई एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने वाली विधि शामिल है। इन तरीकों का उपयोग एनकेजी2डीएल सकारात्मक गैर-एलएससी से ख्यात कैंसर स्टेम सेल गुणों के साथ व्यवहार्य NKG2DL नकारात्मक सेलुलर उपजनसंख्या को अलग करने के लिए किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत किए गए दोनों प्रोटोकॉल सीडी 34 का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषणों द्वारा एएमएल एलएससी के संवर्धन की अनुमति देते हैं, जो एलएससी17का एक ज्ञात मार्कर है, एनकेजी2डीएल सतह अ?...

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Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

हम मानव प्राथमिक तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) नमूनों में NKG2D ligand (NKG2DL) का पता लगाने के लिए दो अलग-अलग धुंधला प्रोटोकॉल पेश करते हैं। पहला दृष्टिकोण एक संलयन प्रोटीन पर आधारित है, जो सभी ज्ञात और संभावित रूप से अभी तक अज्ञात लिगामेंट्स को पहचानने में सक्षम है, जबकि दूसरा प्रोटोकॉल कई एंटी-एनके2डीएल एंटीबॉडी के अलावा पर निर्भर करता है।

एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया में बल्क सबपॉपुलेशन से स्टेम सेल को अलग करने के लिए NKG2D Ligand सतह का पता लगाने के दो प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

यह प्रोटोकॉल एएमएल कोशिकाओं की सतह पर NKG2DLs का पता लगाने के दो अलग तरीके दिखाता है। यह तकनीक सभी ज्ञात और संभवतः अज्ञात NKG2DLs का पता लगाने के लिए एक तेज, उपयोगकर्ता के अनुकूल धुंधला विधि प्रदान करती है। यह विधि थोक एएमएल कोशिकाओं से ल्यूकेमिक स्टेम कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देती है, जिससे इन कोशिकाओं को और अधिक चित्रित करना संभव हो जाता है।कमरे के तापमान पर बायोटिन और NKG2D फ्यूजन प्रोटीन ट्यूबों को विगलन करके शुरू करें। एनकेजी2डी एफसी पाउडर को जल्दी से स्पिन करें, फिर पाउडर का पुनर्गठन करने के लिए पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और पी-1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं। 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक बायोटिन ट्यूब में एनकेजी2डीएल फ्यूजन प्रोटीन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और समाधान को पी-100 माइक्रोपिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।एएमएल कोशिकाओं को गलने के लिए, तरल नाइट्रोजन भंडारण से प्राथमिक एएमएल युक्त क्रायोवियल को हटा दें, और इसे तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें। धीरे-धीरे ट्यूब को पानी में आगे और पीछे ले जाएं, जिससे शीशी की सामग्री गल न जाए जब तक कि केवल एक छोटा सा बर्फ क्रिस्टल न रह जाए। गल कोशिकाओं को तुरंत ट्यूब युक्त माध्यम में स्थानांतरित करें और माध्यम के एक मिलीलीटर का उपयोग करके शीशी को कुल्ला करें।10 मिनट के लिए 300 बार जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को त्याग दें। 10% एफसीएस युक्त आरपीएमआई माध्यम के पांच मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं और अपकेंद्रित्र को दोहराएं। सेल पेलेट को 0.5 गुना 10 की अंतिम एकाग्रता के साथ सातवीं कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर के लिए फिर से खर्च करें।फिर सेल सस्पेंशन के 100 माइक्रोलीटर को सेल कल्चर 96 वेल यू-बॉटम प्लेट में ट्रांसफर करें और 10 मिनट के लिए 300 बार जी पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें। पैलेट को बिना परेशान किए ही सुपरनेट को छोड़ दें। बायोटिनाइलेटेड एनके2डी फ्यूजन प्रोटीन का मास्टर मिश्रण तैयार करें ताकि कोशिकाओं को 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर की अंतिम NKG2D एकाग्रता के साथ अच्छी तरह से 50 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में फिर से निलंबित किया जा सके।तैयार मास्टर मिक्स जोड़ें और 200 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ सेल छर्रों को फिर से रीसुस्ल करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित थाली को इनक्यूबेट और अपकेंद्रित्र करें। स्ट्रेप्टाविडिन पीई का उपयोग करके एक मास्टर मिश्रण तैयार करें ताकि कोशिकाओं को 50 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में फिर से निलंबित किया जा सके।कोशिकाओं में मास्टर मिश्रण जोड़ें और 300 माइक्रोलीटर मल्टीचैनल पिपेट के साथ छर्रों को फिर से खर्च करें। प्लेट को अपकेंद्री करने और सुपरनेट को त्यागने के बाद, बफर प्लस 7-AAD के 200 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को फिर से खर्च करने के लिए 300 माइक्रोलीटर मल्टी-चैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। फिर एक प्रवाह साइटोमेट्री डिवाइस का उपयोग करके कोशिकाओं का विश्लेषण करें।विश्लेषण एएमएल नमूने CD34 और NKG2DL के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन नकारात्मक उपआबादी भी मौजूद है, कुल में चार अलग आबादी के साथ । ठेठ गेटिंग रणनीति उनके एफएससी और एसएससी के माध्यम से कोशिकाओं की मुख्य आबादी के चयन के साथ शुरू होती है। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में डबल्स और डेड सेल्स को बाहर रखा गया है ।सकारात्मक कोशिकाओं की उचित पहचान सुनिश्चित करने के लिए एफएमो नियंत्रण का उपयोग करके फाटकों को समायोजित किया जाता है। सीडी 34 बनाम NKG2DL के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता यहां प्रकाश डाला जाता है । एएमएल कोशिकाएं जो सीडी 34 के लिए सकारात्मक हैं, NKG2DL की निचली सतह अभिव्यक्ति दिखाती हैं, यह दर्शाती है कि NKG2DL अभिव्यक्ति स्टेमनेस की कमी से जुड़ी हुई है।तीन प्राथमिक एएमएल नमूनों में फ्यूजन प्रोटीन के लिए 19.8, 49.8, और 89.4% सकारात्मक घटनाओं का प्रदर्शन किया गया बनाम 20.4, 50.4, और 90.6% पूल्ड एंटी-एनके2डीएल एंटीबॉडी स्टेनिंग के लिए। दूसरी ओर, सिंगल लिगांड स्टेनिंग ने लिगांड के आधार पर अलग-अलग प्रतिशत के साथ 92% तक सकारात्मक घटनाओं की एक श्रृंखला दिखाई। इस विधि का प्रयास करते समय, प्राथमिक एएमएल कोशिकाओं को विगलन करते समय त्वरित होना बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे नाजुक हैं और इस चरण के दौरान आसानी से मर सकते हैं।इस प्रोटोकॉल को करने के बाद, आबादी की जांच करने के लिए एनकेजी2डीएल सिग्नल पर आधारित एक सेल सॉर्ट किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

नमूना और प्रक्रिया के लिए व्यापक प्रोटोकॉल मापने योग्य अवशिष्ट रोग और ल्यूकेमिया से प्रभावित के लिए अस्थि मज्जा तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में स्टेम सेल

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

केंद्रापसारक Elutriation द्वारा विभिंन कोशिका चक्र चरणों में प्राथमिक तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं की तैयारी

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

प्राथमिक तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में और रोगी-व्युत्पंन-xenografts में ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं का अनुमान करने के लिए प्रवाह Cytometry, निदान पर और अनुवर्ती

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

प्राथमिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के चयापचय प्रोफ़ाइल का आकलन

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

नव गठित स्तन कैंसर के प्रवाह Cytometric का पता लगाने के Apoptosis उत्क्रमण के बाद कोशिका की तरह स्टेम सेल

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

यूरीन हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं और एमएल-AF9 प्रेरित ल्यूकेमिया में Mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

वास्तविक समय का पता लगाने और सह संस्कृतियों से इनवेसिव सेल Subpopulations के कैप्चर

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

चूहों में तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया उत्पन्न करने के लिए इंट्रा-पेरिटोनियल प्रत्यारोपण

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

गैर-रेडियोधर्मी केमिलुमिनेसेंस डिटेक्शन का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई की मात्रा निर्धारित करना

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

लेखक स्पॉटलाइट: TAGGG Telomere लंबाई परख के प्रदर्शन मापदंडों का अनुकूलन  

टीएजीजीजी टेलोमेरे लंबाई परख के प्रदर्शन मापदंडों का अनुकूलन

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...