Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione nazionale svizzera per la scienza (179239), della Fondazione per la lotta contro il cancro (Zuerich), della Fondazione Wilhelm Sander a CL (2019.042.1) e della Fondazione Novartis per la ricerca medico-biologica a C.L. Inoltre, questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 765104. Ringraziamo il Flow Cytometry Facility di Basilea per il supporto.

I campioni dei pazienti sono stati raccolti in seguito all'approvazione del Comitato di revisione etica degli ospedali universitari di Basilea e Tuebingen.
1. Biotinilazione della proteina di fusione NKG2D
NOTA: Questo passaggio viene eseguito con un kit di biotinylation (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Questa fase del protocollo deve essere eseguita almeno 24 ore prima della colorazione. La proteina di fusione NKG2D ...

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	<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+cytotoxicity:+how+do+they+pull+the+trigger.">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li><li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+biology:+an+update+and+future+directions.">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Wensveen, F. M., Jelen&#269;i&#263;, V., Poli&#263;, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D:+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness.">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).</li><li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands:+"One+for+All,+All+for+One".">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).</li><li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuity+and+the+single+receptor:+NKG2D.">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li><li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer.">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li><li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D.">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+signaling+by+inhibitory+receptors:+the+NK+cell+paradigm.">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li><li>H&#252;e, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+role+for+NKG2D/MICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease.">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li><li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells.">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium.">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li><li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells.">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li><li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34(-)+fraction.">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li><li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells:+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia.">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li></ol>

Qui presentiamo due metodi citometrici a flusso in grado di rilevare l'espressione di superficie NKG2DL sulle cellule AML primarie umane. Mostriamo che entrambi i metodi di rilevamento possono essere utilizzati in combinazione con altre colorazioni anticorpali (ad esempio, rilevando l'espressione CD34). Colorazioni simili possono essere eseguite anche su altri tipi di cellule primarie e linee cellulari.
Di recente abbiamo dimostrato che l'assenza di NKG2DL sulla superficie delle esplosioni del...

Le cellule NK sono importanti effettori del sistema immunitario innato in grado di riconoscere ed eliminare le cellule maligne o le cellule sane stressate (ad esempio, da un'infezione virale) senza previo stimolo dell'antigene1. Questo processo è strettamente regolato attraverso un complesso repertorio di recettori attivanti - come recettori naturali della citotossicità (NCR), NKG2D e CD16 - e recettori inibitori che sono in gran parte rappresentati da recettori killer simili a immunoglobuline (KIR)2. Il legame dei KIR con le molecole umane di antigene leucocitare (HLA) di classe I su cellule somatiche garantisce l'auto-riconoscimento e trasmette la tolleranza cellulare NK. D'altra parte, l'assenza di auto-riconoscimento e l'aumento del legame dei recettori attivanti ai loro ligandi sulle cellule bersaglio innescano il rilascio di granuli citotossici che portano alla citotossicità mediata dalle cellule NK1. Infine, le cellule NK possono esercitare citotossicità cellulare dipendente dagli anticorpi (ADCC) legando il recettore di attivazione CD16 a bersagli che esprimono la porzione Fc di Ig (FcR)2. Oltre alla citotossicità diretta, le cellule NK possono anche innescare il rilascio di citochine che collega l'innato con il sistema immunitario adattivo3.
NKG2D è un importante recettore attivante espresso su cellule NK, NKT, γδ T e INgenua CD8+ T4 che consente a tali cellule immunitarie citotossiche di riconoscere e lisciviare il ligando NKG2D (NKG2DL) che esprime le cellule bersaglio. Le cellule sane comunemente non esprimono NKG2DL. Invece, l'espressione NKG2DL è upregolata su cellule maligne o infettate da virus per renderle suscettibili al nulla osta immunitario5.
La famiglia umana NKG2DL comprende otto molecole conosciute tra cui le due molecole A e B correlate alla catena MHC I (MICA e MICB6)e le proteine leganti ul16 del citomegalovirus 1-6 (ULBP1-67). L'espressione di NKG2DL è regolata sui livelli trascrizionale, post-trascrizionale e post-traslazione8. Come tale, mentre l'espressione NKG2DL non è comunemente rilevabile sulla superficie di cellule sane, NKG2DL mRNA9 ed espressione proteica intracellulare sono stati riportati nei tessuti sani. La rilevanza funzionale di tale espressione e i meccanismi alla base di tali modelli di espressione discrepant devono ancora esseredefiniti 10.
La regolazione meccanicistica dell'espressione NKG2DL nelle cellule tumorali è un'affascinante area di indagine. Le vie note per essere coinvolte nello stress cellulare, ad esempio la via di stress da shocktermico 9,o le vie associate al danno al DNA, come l'atassia telangiectasia mutata (ATM) e la via11correlata a Rad3 (ATR), così come le infezioni virali o batteriche sono state direttamente collegate all'induzione dell'espressione NKG2DL12. Tuttavia, anche se l'espressione superficiale di NKG2DL è stata efficacemente indotta, questa espressione può essere persa di nuovo attraverso lo spargimento mediato proteoliticamente, un meccanismo associato alla fuga immunitaria e alla scarsa prognosi clinica in alcuni tumori13.
L'assenza di superficie cellulare NKG2DL può anche svolgere ruoli importanti nei pazienti con AML. Qui, il trattamento con chemioterapia intensiva spesso induce remissione, ma la ricaduta si verifica spesso da cellule staminali leucemiche (LSC), che sopravvivono selettivamente alle chemioterapie ed eludono la risposta immunitaria. Come abbiamo dimostrato di recente, gli LSC, ad esempio, sfuggono alla lisi cellulare NK sopprimendo l'espressione di superficie NKG2DL14.
Inversamente, l'assenza di espressione di NKG2DL superficiale può essere utilizzata come metodo per identificare e isolare vibilmente sottopopolazioni putative simili a staminali di cellule dalle sottopopolazioni leucemiche di controparte sfusa. Qui, presentiamo due approcci citometrici a flusso che possono essere utilizzati per rilevare l'espressione superficiale NKG2DL e quindi identificare le cellule staminali negative NKG2DL nella leucemia e forse anche in altri tumori: un metodo per il riconoscimento della superficie pan-ligando e un metodo che prevede la colorazione con anticorpi singoli o raggruppati che riconoscono singole proteine NKG2DL conosciute.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

All'interno dello stesso paziente, l'assenza di espressione superficiale dei ligandi NKG2D (NKG2DL) ha dimostrato di distinguere le sottopopolazioni leucemiche con proprietà delle cellule staminali (le cosiddette cellule staminali leucemiche, LSC) da cellule leucemiche di controparte più differenziate che mancano di potenziale di iniziazione della malattia sebbene portino mutazioni genetiche specifiche della leucemia simili. Gli NKG2DL sono auto-molecole simili a MHC di classe I, biochimicamente molto diverse. Le cellule sane in condizioni omeostatiche generalmente non esprimono NKG2DL sulla superficie cellulare. Invece, l'espressione di questi ligandi è indotta dall'esposizione allo stress cellulare (ad esempio, trasformazione oncogenica o stimoli infettivi) per innescare l'eliminazione delle cellule danneggiate attraverso lalisi attraverso cellule immunitarie che esprimono il recettore NKG2D come le cellule natural killer (NK). È interessante notare che l'espressione superficiale di NKG2DL viene soppressa selettivamente nelle sottopopolazioni LSC, consentendo a queste cellule di eludere la sorveglianza immunitaria mediata da NKG2D. Qui, presentiamo un'analisi affiancata di due diversi metodi di citometria a flusso che consentono lo studio dell'espressione superficiale di NKG2DL sulle cellule tumorali, cioè un metodo che prevede il riconoscimento del pan-ligando e un metodo che prevede la colorazione con anticorpi multipli contro singoli ligandi. Questi metodi possono essere utilizzati per separare le sottopopolazioni cellulari negative NKG2DL vitali con proprietà putative delle cellule staminali tumorali dal NKG2DL positivo non LSC.

Entrambi i protocolli qui presentati consentono l'arricchimento di AML LSC mediante analisi citometriche di flusso utilizzando CD34, un marcatore noto di LSC17, in combinazione con l'espressione superficiale NKG2DL utilizzando il riconoscimento pan-ligando o macchiando con anticorpi raggruppati contro singoli ligandi. Nella figura 1, mostriamo che i campioni di AML analizzati sono positivi per CD34 e NKG2DL, ma esistono anche sottopopolazioni negative, che è mostrata...

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Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Presentiamo due diversi protocolli di colorazione per il rilevamento del ligando NKG2D (NKG2DL) nei campioni di leucemia mieloide acuta primaria umana (AML). Il primo approccio si basa su una proteina di fusione, in grado di riconoscere tutti i ligandi noti e potenzialmente ancora sconosciuti, mentre il secondo protocollo si basa sull'aggiunta di anticorpi anti-NKG2DL multipli.

Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Questo protocollo mostra due modi distinti di rilevare NKG2DL sulla superficie delle celle AML. La tecnica fornisce un metodo di colorazione veloce e intuitivo per rilevare tutti gli NKG2DL noti e possibilmente sconosciuti. Questo metodo consente la separazione delle cellule staminali leucemiche dalle cellule AML sfuse, il che consente di caratterizzare ulteriormente queste cellule.Inizia scongelando la biotina e i tubi proteici di fusione NKG2D a temperatura ambiente. Far girare rapidamente la polvere NKG2D FC, quindi aggiungere 500 microlitri di PBS per ricostituire la polvere e mescolare accuratamente utilizzando una micropipetta P-1000. Aggiungere 100 microlitri della proteina di fusione NKG2DL a un tubo di biotina per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e mescolare accuratamente la soluzione con una micropipetta P-100.Per scongelare le celle AML, rimuovere l'AML crioviale contenente L'AML primario dallo stoccaggio di azoto liquido e posizionarlo immediatamente in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Spostare delicatamente il tubo avanti e indietro nell'acqua, permettendo al contenuto del flaconcino di scongelarsi fino a quando non rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio. Trasferire immediatamente le cellule scongelate nel tubo contenente il mezzo e sciacquare il flaconcino utilizzando un millilitro di mezzo.Centrifugare le cellule a 300 volte G per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Lavare le celle con cinque millilitri di mezzo RPMI contenente il 10%FCS e ripetere la centrifugazione. Rimorsiva il pellet cellulare con tampone di colorazione ad una concentrazione finale di 0,5 per 10 alla settima cella per millilitro.Quindi trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare su una piastra inferiore a U 96 del pozzo e centrifugare la piastra a 300 volte G per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Preparare un mix master di proteine di fusione NKG2D biotinylate in modo che le cellule siano rimorsipendate in un volume finale di 50 microlitri per pozzo con una concentrazione finale di NKG2D di 10 microgrammi per millilitro per pozzo.Aggiungere il master mix preparato e rimorsipare il pellet di cella con una pipetta da 200 microliter. Incubare e centrifugare la lastra come descritto nel manoscritto testuale. Preparare un master mix utilizzando streptavidina PE in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 microlitri.Aggiungere il mix master alle celle e rimorsi il pellet con una pipetta multicanale da 300 microliter. Dopo aver centrifugato la piastra e scartato il supernatante, utilizzare una micropipetta multicanale da 300 microlitri per rimescolare i pellet cellulari in 200 microlitri di tampone di colorazione più 7-AAD. Quindi analizzare le cellule utilizzando un dispositivo di citometria a flusso.I campioni di AML analizzati sono positivi per CD34 e NKG2DL, ma esistono anche sottopopolazioni negative, con quattro diverse popolazioni in totale. La tipica strategia di gating inizia con la selezione della popolazione principale di cellule attraverso il loro FSC e SSC. Doppietti e cellule morte sono esclusi nell'analisi a valle.I cancelli vengono regolati utilizzando i controlli FMO per garantire una corretta identificazione delle cellule positive. Le intensità di fluorescenza delle cellule positive per CD34 rispetto a NKG2DL sono evidenziate qui. Le cellule AML positive per CD34 mostrano una minore espressione superficiale di NKG2DL, che indica che l'espressione NKG2DL è associata alla mancanza di staminali.Tre campioni di AML primari hanno dimostrato eventi positivi del 19,8, 49,8 e 89,4% per la colorazione delle proteine di fusione rispetto al 20,4, 50,4 e 90,6% per la colorazione degli anticorpi anti-NKG2DL in pool. D'altra parte, la colorazione del ligando singolo ha mostrato una serie di eventi positivi fino al 92% con percentuali variabili in base al ligando. Quando si tenta questo metodo, è molto importante essere veloci quando si scongelano le cellule AML primarie, perché sono fragili e possono morire facilmente durante questo passaggio.Dopo aver eseguito questo protocollo, è possibile eseguire un ordinamento cellulare basato sul segnale NKG2DL per indagare ulteriormente le popolazioni.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flusso Cytometric Detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo l'inversione di apoptosi

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

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Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Analisi citometrica a flusso di biomarcatori apoptotici in cellule di cancro cervicale SiHa trattate con attinomicina D

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Rilevamento e acquisizione in tempo reale di sottopopolazioni cellulari invasive da co-colture

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Trapianto intra-peritoneale per la generazione di leucemia mieloide acuta nei topi

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...