Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (179239), 암 퇴치 재단 (Zuerich), CL에 빌헬름 산더 재단 (2019.042.1), 그리고 C.L에 의료 생물 연구를위한 노바티스 재단의 보조금에 의해 지원되었다. 또한, 이 프로젝트는 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 번호 765104 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았습니다. 바젤의 플로우 세포측정 시설에 감사드립니다.

환자 샘플은 바젤과 투빙겐 대학 병원의 윤리 검토 위원회의 승인에 따라 수집되었습니다.
1. NKG2D 융합 단백질의 바이오티니클레이션
참고: 이 단계는 제조업체의지시에 따라 생체 개화 키트(재료 표 참조)로 수행됩니다. 프로토콜의 이 단계는 염색하기 전에 적어도 24시간 수행되어야 합니다. 생체화 NKG2D 융합 단백질은 -20°C에 보관되어야 한?...

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여기서 우리는 인간 1차 AML 세포에서 NKG2DL 표면 발현을 검출할 수 있는 2개의 유동 세포측정 방법을 제시합니다. 우리는 두 가지 검출 방법이 다른 항체 염색체와 함께 사용될 수 있음을 보여줍니다 (예를 들어, CD34 발현을 검출). 유사한 얼룩은 또한 그밖 1 차적인 세포 모형 및 세포주에서 수행될 수 있습니다.
우리는 최근에 AML 환자 폭발의 표면에 NKG2DL의 부재가 LSC<sup class="xre...

NK 세포는 선행 항원 자극1없이 악성 세포 또는 스트레스가 있는 건강한 세포(예를 들어, 바이러스 감염에 의한)를 인식하고 제거할 수 있는 선천성 면역 계통의 중요한 이펙터이다. 이 과정은 자연 세포 독성 수용체(NcRs), NKG2D 및 CD16과 같은 활성 수용체의 복잡한 레퍼토리를 통해 엄격하게 조절되며, 주로 킬러 면역글로불린과 같은 수용체(KIRs)2에의해 표현되는 억제 수용체(IS) 2. 체세포에 대한 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 분자에 대한 KIRs의 결합은 자가 인식을 보장하고 NK 세포 내성을 전달합니다. 한편, 표적 세포상에서 자신의 리간드에 수용체를 활성화시키는 자기 인식및 증가된 결합의 부재는 NK 세포 매개 세포 독성1로이어지는 세포독성 과립의 방출을 유발한다. 마지막으로, NK 세포는 Ig(FcR) 2의 Fc 부분을 발현하는 표적에 활성 수용체 CD16의 결합을 함으로써 항체 의존성 세포 세포 독성(ADCC)을 발휘할 수있다. 직접적인 세포 독성 외에도, NK 세포는 적응형 면역 계통3을가진 선천적인 브리징 사이토카인 방출을 시작할 수 있다.
NKG2D는 NK, NKT, γδ T 및 순진한 CD8+ T 세포4에 발현된 주요 활성화 수용체로, 이러한 세포독성 면역 세포가 표적 세포를 현현하는 NKG2D 리간드(NKG2DL)를 인식하고 라이세할 수 있게 한다. 건강한 세포는 일반적으로 NKG2DL을 발현하지 않습니다. 대신, NKG2DL 발현은 악성 또는 바이러스에 감염된 세포에 대해 이러한 면역 통관5에대한 의존성 있게 하기 위해 과소 조절된다.
인간 NKG2DL 제품군은 2개의 MHC I 사슬 관련 분자 A와 B(MICA 및 MICB6)및 사이토메갈로바이러스 UL16 결합 단백질 1-6 (ULBP1-67)이있는 8개의 공지된 분자를 포함한다. NKG2DL의 발현은 전사, 포스트 전사뿐만 아니라 번역 후 수준8에규제된다. 이와 같이, NKG2DL 발현은 건강한 세포의 표면에서 일반적으로 검출할 수 없지만, NKG2DL mRNA9 및 세포내 단백질 발현은 건강한 조직에서 보고되었다. 이러한 표현식의 기능적 관련성및 이러한 불일치 식 패턴의 기본 메커니즘은10으로정의되어야 한다.
암세포에서 NKG2DL 발현의 기계론적 조절은 매혹적인 조사 영역이다. 세포 스트레스, 예를 들어, 열 충격 응력경로(9)또는 DNA 손상 관련 경로(ATM) 및 Rad3 관련(ATR)경로(11)와같은 DNA 손상 관련 경로뿐만 아니라 바이러스 또는 세균 감염이 NKG2DL 발현12의유도에 직접 연결되어 왔다. 그러나, NKG2DL의 표면 발현이 효과적으로 유도되더라도, 이러한 발현은 일부암(13)에서면역 탈출 및 열악한 임상 예후와 관련된 기전인 프로테오리틱 중재 흘리기(proteolytic-mediated 흘리기)를 통해 다시 손실될 수 있다.
세포 표면 NKG2DL의 부재는 또한 AML를 가진 환자에서 중요한 역할을 할 수 있습니다. 여기서, 집중적인 화학요법을 가진 처리는 수시로 면제를 유도합니다, 그러나 재발은 수시로 화학요법을 생존하고 면역 반응을 회피하는 백혈병 줄기 세포 (LSC)에서 수시로 생깁니다. 최근에 나타난 바와 같이, LSC는 예를 들어 NKG2DL 표면발현(14)을억제하여 NK 셀 용해를 탈출한다.
반대로, 표면 NKG2DL 발현의 부재는 대량 대응 백혈병 하위 집단으로부터 세포의 세포줄기와 같은 하위 집단을 식별하고 유리하게 분리하는 방법으로 사용될 수 있다. 여기서, 우리는 NKG2DL 표면 발현을 검출하고 따라서 백혈병에 있는 NKG2DL 음성 줄기 세포를 확인하고 그(것)들을 확인하는 2개의 유동 세포 측정 접근법을 제시합니다: 범리간 표면 인식을 위한 방법 및 개별적인 NKG2DL 단백질을 인식하는 단 하나 또는 풀링된 항체로 염색하는 방법을.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

동일한 환자 내에서, NKG2D 리간드 (NKG2DL) 표면 발현의 부재는 유사한 백혈병 특정 유전 돌연변이를 전송하지만 질병 개시 잠재력이 부족한 보다 분화된 상대 백혈병 세포로부터 줄기 세포 특성(소위 백혈병 줄기 세포, LSC)을 가진 백혈병 하위 집단을 구별하는 것으로 나타났다. NKG2DL은 생화학적으로 매우 다양한 MHC 클래스 I-like 자가 분자입니다. 상근 성 조건에서 건강한 세포는 일반적으로 세포 표면에 NKG2DL을 발현하지 않습니다. 대신, 이러한 리간드의 발현은 NKG2D 수용체 표현 면역 세포를 통해 용해를 통해 손상된 세포의 제거를 촉발하기 위해 세포 스트레스(예를 들어, 온코겐성 변환 또는 전염성 자극)에 노출되면 유도되어 천연 킬러(NK) 세포와 같은 면역 세포를 발현한다. 흥미롭게도, NKG2DL 표면 발현은 LSC 하위 집단에서 선택적으로 억제되어 이러한 세포가 NKG2D 매개 면역 감시를 회피할 수 있게 합니다. 여기서, 우리는 암세포에 대한 NKG2DL 표면 발현의 조사를 허용하는 2개의 상이한 유동 세포측정 방법에 대한 나란히 분석을 제시하고, 단일 리간드에 대하여 다중 항체로 염색하는 것을 포함하는 범리간 인식 및 방법을 관련시키는 방법. 이러한 방법은 NKG2DL 양성 비 LSC로부터 세포암 줄기 세포 특성을 가진 실행 가능한 NKG2DL 음성 세포 하위 집단을 분리하는 데 사용될 수 있다.

여기에 제시된 두 프로토콜 모두 LSC17의알려진 마커인 CD34를 사용하여 AML LSC의 농축을 허용하며, NKG2DL 표면 발현과 함께 개별 리간드에 대한 풀링된 항체로 염색함으로써. 도 1에서,분석된 AML 샘플은 CD34 및 NKG2DL에 대해 양수이지만 부정적인 하위 집단도 존재하며, 이는 총 4개의 상이한 집단의 존재에 의해 나타난다. 우리의 데이터는 그들의 FSC와 SSC를 통해 ...

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Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

우리는 인간 1 차급성 골수성 백혈병 (AML) 견본에 있는 NKG2D 리간드 (NKG2DL) 검출을 위한 2개의 다른 염색 프로토콜을 제시합니다. 첫 번째 접근법은 융합 단백질을 기반으로 하며, 알려진 모든 잠재적으로 알려지지 않은 리간드를 인식할 수 있으며, 두 번째 프로토콜은 다중 항 NKG2DL 항체의 첨가에 의존한다.

급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

이 프로토콜은 AML 셀 표면에서 NKG2DL을 검출하는 두 가지 뚜렷한 방법을 보여줍니다. 이 기술은 알려진 NKG2DL을 모두 감지하는 빠르고 사용자 친화적인 염색 방법을 제공합니다. 이 방법은 대량 AML 세포에서 백혈병 줄기 세포의 분리를 허용, 이는 더 이러한 세포를 특성화 할 수 있도록.비오틴과 NKG2D 융합 단백질 튜브를 실온에서 해동하는 것으로 시작합니다. NKG2D FC 파우더를 빠르게 스핀다운한 다음 500마이크로리터의 PBS를 추가하여 분말을 재구성하고 P-1000 마이크로파이프를 사용하여 철저히 혼합합니다. NKG2DL 융합 단백질 100마이크로리터를 비오틴 튜브에 추가하여 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도를 얻고, P-100 마이크로파이프와 용액을 완전히 혼합합니다.AML 세포를 해동하려면 액체 질소 저장에서 1 차 AML을 함유하는 극저온을 제거하고 즉시 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 튜브를 물 속앞뒤로 부드럽게 움직여 작은 얼음 결정만 남을 때까지 유리병의 내용물이 해동할 수 있도록 합니다. 해동된 세포를 튜브를 함유하는 배지로 즉시 옮기고 1밀리리터의 배지를 사용하여 바이알을 헹구십시오.세포를 300배 G에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 버립니다. 10%FCS를 함유한 RPMI 배지 5밀리리터로 세포를 세척하고 원심분리를 반복합니다. 염색 버퍼로 세포 펠릿을 밀리리터당 7번째 세포에 0.5배 10배의 최종 농도로 재차판으로 재차판한다.그런 다음 셀 현탁액의 100 마이크로리터를 세포 배양(96)에 잘 U-바닥 플레이트로 옮기고 10분 동안 300회 G로 플레이트를 원심분리한다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오. 생체화 NKG2D 융합 단백질의 마스터 믹스를 준비하여 세포가 웰당 밀리리터 당 10 마이크로그램의 최종 NKG2D 농도로 잘 혼합된 50 마이크로리터의 최종 부피로 재장매됩니다.준비된 마스터 믹스를 추가하고 200 마이크로리터 파이펫으로 셀 펠릿을 다시 처리합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 플레이트를 배양하고 원심분리합니다. 세포가 50 마이크로리터의 최종 부피에서 다시 중단되도록 스트렙타비딘 PE를 사용하여 마스터 믹스를 준비합니다.마스터 믹스를 세포에 추가하고 300 마이크로리터 멀티채널 파이펫으로 펠릿을 다시 처리합니다. 플레이트를 원심분리하고 상체를 폐기한 후, 300 마이크로리터 멀티 채널 마이크로파이프를 사용하여 염색 버퍼 200 마이크로리터와 7-AAD의 세포 펠릿을 재보페한다. 그런 다음 유동 세포측정 장치를 사용하여 세포를 분석합니다.분석된 AML 샘플은 CD34 및 NKG2DL에 대해 양수이지만 부정적인 하위 집단도 존재하며 총 4개의 서로 다른 집단이 있습니다. 일반적인 게이팅 전략은 FSC 및 SSC를 통해 세포의 주요 인구의 선택으로 시작합니다. 이중 및 죽은 세포는 다운스트림 분석에서 제외됩니다.게이트는 FMO 컨트롤을 사용하여 조정되어 양수 셀을 적절하게 식별할 수 있습니다. NKG2DL 대 CD34에 대해 양성 세포의 형광 강도가 여기에 강조된다. CD34에 대해 양성인 AML 세포는 NKG2DL의 낮은 표면 발현을 나타내며, 이는 NKG2DL 발현이 줄기 부족과 연관되어 있음을 나타낸다.3개의 1차 AML 샘플은 풀링된 항NKG2DL 항체 염색에 대해 융합 단백질 염색에 대한 19.8, 49.8 및 89.4%의 양성 발생을 입증하였다. 한편, 단일 리간드 염색은 리간드에 따라 백분율이 달라진 92%까지 다양한 긍정적인 이벤트를 보였다. 이 방법을 시도할 때, 1차 AML 세포를 해동할 때, 깨지기 쉽고 이 단계에서 쉽게 죽을 수 있기 때문에 빠를 것이 매우 중요합니다.이 프로토콜을 수행한 후 NKG2DL 신호를 기반으로 하는 셀 정렬을 수행하여 인구를 더 자세히 조사할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

연구

암 연구학

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Actinomycin D-Treated SiHa 자궁경부암 세포에서 세포사멸 바이오마커의 유세포 분석

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

생쥐에서 급성 골수성 백혈병을 발생시키기 위한 복강내 이식

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...