Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Denne studien ble støttet av tilskudd fra Swiss National Science Foundation (179239), Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), Wilhelm Sander Foundation to CL (2019.042.1) og Novartis Foundation for medisinsk-biologisk forskning til C.L. Videre har dette prosjektet fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen Nr. 765104. Vi takker Flow Cytometry Facility i Basel for støtte.

Pasientprøver ble samlet inn etter godkjenning fra Etikkutvalget ved Universitetssykehusene Basel og Tuebingen.
1. Biotinylering av NKG2D fusjonsprotein
MERK: Dette trinnet utføres med et biotinyleringssett (se Materialliste) i henhold til produsentens anvisninger. Dette trinnet i protokollen må utføres minst 24 timer før fargingen. Det biotinylerte NKG2D fusjonsproteinet skal oppbevares ved -20 °C.
<ol><li>Tine både biotinet og NKG2D fusjo...

<ol>
	<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+cytotoxicity:+how+do+they+pull+the+trigger.">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li><li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+biology:+an+update+and+future+directions.">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Wensveen, F. M., Jelen&#269;i&#263;, V., Poli&#263;, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D:+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness.">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).</li><li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands:+"One+for+All,+All+for+One".">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).</li><li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuity+and+the+single+receptor:+NKG2D.">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li><li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer.">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li><li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D.">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+signaling+by+inhibitory+receptors:+the+NK+cell+paradigm.">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li><li>H&#252;e, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+role+for+NKG2D/MICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease.">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li><li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells.">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium.">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li><li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells.">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li><li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34(-)+fraction.">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li><li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells:+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia.">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li></ol>

Her presenterer vi to strømningscytometriske metoder som kan oppdage NKG2DL overflateuttrykk på humane primære AML-celler. Vi viser at begge deteksjonsmetodene kan brukes sammen med andre antistofffarginger (f.eks. oppdage CD34-uttrykk). Lignende flekker kan også utføres på andre primære celletyper og cellelinjer.
Vi viste nylig at fraværet av NKG2DL på overflaten av AML pasient eksplosjoner kan berike LSC14. I AML har NKG2DL-negative, men ikke NKG2DL positive ...

NK-celler er viktige effektorer av det medfødte immunsystemet som kan gjenkjenne og eliminere ondartede celler eller stressede friske celler (f.eks. ved en virusinfeksjon) uten tidligere antigenstimulering1. Denne prosessen reguleres tett via et komplekst repertoar av aktiverende reseptorer – for eksempel naturlige cytotoksisitetsreseptorer (NCRs), NKG2D og CD16 – og hemmende reseptorer som i stor grad er representert av killer immunoglobulin-lignende reseptorer (KIRs)2. Binding av KIRs til humant leukocyttantigen (HLA) klasse I-molekyler på somatiske celler sikrer selvgjenkjenning og formidler NK-celletoleranse. På den annen side utløser fravær av selvgjenkjenning og økt binding av aktiverende reseptorer til deres ligander på målcellene frigjøring av cytotoksiske granulater som fører til NK-cellemediert cytotoksisitet1. Til slutt kan NK-celler utøve antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) ved å binde den aktiverende reseptoren CD16 til mål som uttrykker Fc-delen av Ig (FcR)2. Bortsett fra direkte cytotoksisitet, kan NK-celler også utløse cytokinfrigjøring som bygger bro over det medfødte med det adaptive immunsystemet3.
NKG2D er en stor aktiveringsreseptor uttrykt på NK, NKT, γδ T og naive CD8+ T-celler4 som gjør det mulig for slike cytotoksiske immunceller å gjenkjenne og lyse NKG2D ligand (NKG2DL) som uttrykker målceller. Friske celler uttrykker vanligvis ikke NKG2DL. I stedet er NKG2DL-uttrykket oppregulert på ondartede eller virusinfiserte celler for å gjøre disse mottagelige for immunclearance5.
Den menneskelige NKG2DL-familien består av åtte kjente molekyler blant hvilke de to MHC I kjederelaterte molekylene A og B (MICA og MICB6) og cytomegaloviruset UL16-bindende proteiner 1-6 (ULBP1-67). Uttrykket NKG2DL er regulert på transkripsjons-, posttranskripsjons- og postoversettelsesnivåene8. Som sådan, mens NKG2DL-uttrykk vanligvis ikke kan påvises på overflaten av sunne celler, ble NKG2DL mRNA9 og intracellulært proteinuttrykk rapportert i sunt vev. Den funksjonelle relevansen av et slikt uttrykk og mekanismene som ligger til grunn for slike diskrete uttrykksmønstre, gjenstår å definere10.
Den mekanistiske reguleringen av NKG2DL-uttrykket i kreftcellene er et fascinerende undersøkelsesområde. Veier som er kjent for å være involvert i enten cellulært stress, for eksempel varmesjokkspenningsveien9, eller DNA-skaderelaterte veier, for eksempel ataksi telangiectasia mutert (ATM) og Rad3-relatert (ATR) sti11, samt virus- eller bakterieinfeksjoner har vært direkte knyttet til induksjonen av NKG2DL-uttrykk12. Men selv om overflateuttrykket til NKG2DL har blitt effektivt indusert, kan dette uttrykket gå tapt igjen gjennom proteolytisk mediert shedding, en mekanisme forbundet med immunflukt og dårlig klinisk prognose i noen kreftformer13.
Fraværet av celleoverflate NKG2DL kan også spille viktige roller hos pasienter med AML. Her induserer behandling med intensiv kjemoterapi ofte remisjon, men tilbakefall oppstår ofte fra leukemiske stamceller (LSC), som selektivt overlever kjemoterapi og unngår immunrespons. Som vi nylig viste, unnslipper LSC-er for eksempel NK-cellelys ved å undertrykke NKG2DL overflateuttrykk14.
Omvendt kan fraværet av overflate NKG2DL-uttrykk brukes som en metode for å identifisere og dyktig isolere putative stammelignende subpopulasjoner av celler fra bulk motpart leukemiske subpopulasjoner. Her presenterer vi to strømningscytometriske tilnærminger som kan brukes til å oppdage NKG2DL overflateuttrykk og dermed identifisere NKG2DL negative stamceller i leukemi og kanskje også i andre kreftformer: En metode for pan-ligand overflategjenkjenning og en metode som involverer farging med enkelt- eller samlede antistoffer som gjenkjenner individuelle kjente NKG2DL-proteiner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

Innenfor samme pasient ble fravær av NKG2D ligander (NKG2DL) overflateuttrykk vist seg å skille leukemiske subpopulations med stamcelleegenskaper (såkalte leukemiske stamceller, LSC) fra mer differensierte motpart leukemiske celler som mangler sykdom initiering potensial selv om de bærer lignende leukemi spesifikke genetiske mutasjoner. NKG2DL er biokjemisk svært varierte MHC klasse I-lignende selvmolekyler. Friske celler i homeostatiske forhold uttrykker vanligvis ikke NKG2DL på celleoverflaten. I stedet blir uttrykk for disse ligandene indusert ved eksponering for cellulær stress (f.eks. onkogen transformasjon eller smittsomme stimuli) for å utløse eliminering av skadede celler via lysis gjennom NKG2D-reseptor-uttrykkende immunceller som naturlige morderceller (NK). Interessant nok er NKG2DL overflateuttrykk selektivt undertrykt i LSC-subpopulasjoner, slik at disse cellene kan unngå NKG2D-mediert immunovervåking. Her presenterer vi en side-ved-side-analyse av to forskjellige strømningscytometrimetoder som gjør det mulig å undersøke NKG2DL overflateuttrykk på kreftceller, det vil si en metode som involverer pan-ligandgjenkjenning og en metode som involverer farging med flere antistoffer mot enkeltligander. Disse metodene kan brukes til å skille levedyktige NKG2DL negative cellulære subpopulasjoner med putative kreft stamcelleegenskaper fra NKG2DL positiv ikke-LSC.

Begge protokollene som presenteres her tillater berikelse av AML LSC ved strømningscytometriske analyser ved hjelp av CD34, en kjent markør for LSC17, i kombinasjon med NKG2DL overflateuttrykk ved enten å bruke pan-ligand anerkjennelse eller farging med samlede antistoffer mot individuelle ligander. I figur 1viser vi at de analyserte AML-prøvene er positive for CD34 og NKG2DL, men det finnes også negative delpopulasjoner, som vises ved tilstedeværelsen av fire f...

Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Vi presenterer to forskjellige fargeprotokoller for NKG2D ligand (NKG2DL) deteksjon i humane primære akutte myeloid leukemi (AML) prøver. Den første tilnærmingen er basert på et fusjonsprotein, i stand til å gjenkjenne alle kjente og potensielt ukjente ligander, mens den andre protokollen er avhengig av tilsetning av flere anti-NKG2DL antistoffer.

To flowcytometriske tilnærminger til NKG2D Ligand overflatedeteksjon for å skille stamceller fra bulk subpopulations i akutt myeloid leukemi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Denne protokollen viser to forskjellige måter å oppdage NKG2DLer på overflaten av AML-celler. Teknikken gir en rask, brukervennlig fargingsmetode for å oppdage alle kjente og muligens ukjente NKG2DLer. Denne metoden gjør det mulig å separere leukemiske stamceller fra bulk AML-celler, noe som gjør det mulig å karakterisere disse cellene ytterligere.Begynn med å tine biotinet og NKG2D fusjonsproteinrørene ved romtemperatur. Spinn raskt ned NKG2D FC pulveret, tilsett deretter 500 mikroliter PBS for å rekonstituere pulveret og bland grundig ved hjelp av en P-1000 mikropipette. Tilsett 100 mikroliter NKG2DL fusjonsprotein til et biotinrør for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 mikrogram per milliliter, og bland løsningen grundig med en P-100 mikropipette.For å tine AML-cellene, fjern kryonalen som inneholder primær AML fra lagring av flytende nitrogen, og plasser den umiddelbart i et 37 grader Celsius vannbad. Beveg røret forsiktig frem og tilbake i vannet, slik at innholdet i hetteglasset kan tine til det bare er en liten iskrystall igjen. Overfør straks de tinte cellene inn i mediet som inneholder røret og skyll hetteglasset med en milliliter medium.Sentrifuger cellene ved 300 ganger G i 10 minutter og kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Vask cellene med fem milliliter RPMI-medium som inneholder 10% FCS og gjenta sentrifugeringen. Resuspend cellepellet med farging buffer til en endelig konsentrasjon på 0,5 ganger 10 til syvende celler per milliliter.Overfør deretter 100 mikroliter av cellefjæringen til en cellekultur 96 brønn U-bunnplate og sentrifuger platen ved 300 ganger G i 10 minutter. Kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Forbered en masterblanding av biotinylert NKG2D fusjonsprotein slik at cellene resuspenderes i et sluttvolum på 50 mikroliter per brønn med en endelig NKG2D-konsentrasjon på 10 mikrogram per milliliter per brønn.Tilsett den tilberedte masterblandingen og resuspender cellepellets med en 200 mikroliterpipette. Inkuber og sentrifuger platen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Forbered en mesterblanding ved hjelp av streptavidin PE slik at cellene resuspenderes i et sluttvolum på 50 mikroliter.Tilsett hovedblandingen i cellene og resuspender pelletsene med en 300 mikroliter flerkanals pipette. Etter sentrifugering av platen og kassering av supernatanten, bruk en 300 mikroliter flerkanals mikropipette for å resuspendere cellepellets i 200 mikroliter fargebuffer pluss 7-AAD. Analyser deretter cellene ved hjelp av en strømningscytometrienhet.De analyserte AML-prøvene er positive for CD34 og NKG2DL, men det finnes også negative delpopulasjoner, med fire forskjellige populasjoner totalt. Den typiske gatingstrategien starter med valg av hovedpopulasjonen av celler via deres FSC og SSC. Doble og døde celler er utelukket i nedstrømsanalysen.Portene justeres ved hjelp av FMO-kontroller for å sikre riktig identifisering av positive celler. Fluorescensintensitetene til celler som er positive for CD34 versus NKG2DL er fremhevet her. AML-celler som er positive for CD34, viser et lavere overflateuttrykk av NKG2DL, noe som indikerer at NKG2DL-uttrykk er forbundet med mangel på stemness.Tre primære AML-prøver viste 19,8, 49,8 og 89,4 % positive hendelser for fusjonsproteinfarging versus 20,4, 50,4 og 90,6 % for de samlede anti-NKG2DL antistofffargingene. På den annen side viste enkeltligafargede en rekke positive hendelser opp til 92%, med prosentandelene varierende basert på ligand. Når du prøver denne metoden, er det svært viktig å være rask når du tiner de primære AML-cellene, fordi de er skjøre og kan dø lett i løpet av dette trinnet.Etter å ha utført denne protokollen, kan en cellesortering basert på NKG2DL-signalet utføres for å undersøke populasjonene ytterligere.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Forberedelse av primære akutt lymfatisk leukemi celler i forskjellige cellen syklus faser av sentrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow cytometri å anslå leukemi stamceller i primære akutt myelogen leukemi og pasient-avledet-xenografts, diagnose og følge opp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flow Cytometric påvisning av nydannede brystkreft stilk cellen som celler etter apoptose reversering

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Flowcytometrisk analyse av apoptotiske biomarkører i Actinomycin D-behandlede SiHa livmorhalskreftceller

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Sanntidsdeteksjon og fangst av invasive celledelpopulasjoner fra samkulturer

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Intraperitoneal transplantasjon for generering av akutt myelogen leukemi hos mus

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...