Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciência da Suíça (179239), da Fundação para o Combate ao Câncer (Zuerich), da Fundação Wilhelm Sander à CL (2019.042.1) e da Fundação Novartis para pesquisa médico-biológica para C.L. Além disso, este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie 765104. Agradecemos o apoio da Instalação de Citometria de Fluxo em Basileia.

As amostras dos pacientes foram coletadas após aprovação do Conselho de Revisão ética dos Hospitais Universitários de Basileia e Tuebingen.
1. Biotintilação da proteína de fusão NKG2D
NOTA: Esta etapa é realizada com um kit de biotiningação (ver Tabela de Materiais) de acordo com a instrução do fabricante. Esta etapa do protocolo deve ser realizada pelo menos 24 horas antes da coloração. A proteína de fusão NKG2D biotinilada deve se...

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Aqui apresentamos dois métodos citométricos de fluxo que podem detectar a expressão da superfície NKG2DL em células LMA primárias humanas. Mostramos que ambos os métodos de detecção podem ser usados em conjunto com outras manchas de anticorpos (por exemplo, detectando a expressão CD34). Manchas semelhantes também podem ser realizadas em outros tipos de células primárias e linhas celulares.
Recentemente, mostramos que a ausência de NKG2DL na superfície das explosões de pacientes...

As células NK são efeitos importantes do sistema imunológico inato que podem reconhecer e eliminar células malignas ou células saudáveis estressadas (por exemplo, por uma infecção viral) sem estimulação prévia de antígeno1. Esse processo é fortemente regulado através de um complexo repertório de receptores ativadores — como receptores de citotoxicidade natural (NCRs), NKG2D e CD16 — e receptores inibitórios que são em grande parte representados por receptores semelhantes à imunoglobulina assassina (KIRs)2. A ligação de KIRs com moléculas de antígeno leucócito humano (HLA) em células somáticas garante o auto-reconhecimento e transmite tolerância celular NK. Por outro lado, a ausência de auto-reconhecimento e o aumento da vinculação de receptores ativados aos seus ligantes nas células-alvo desencadeiam a liberação de grânulos citotóxicos que levam à citotoxicidade mediada por células NK1. Finalmente, as células NK podem exercer citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) vinculando-se ao receptor de ativação CD16 a alvos que expressam a porção fc de Ig (RF)2. Além da citotoxicidade direta, as células NK também podem desencadear a liberação de citocinas conectando o inato com o sistema imunológico adaptativo3.
NKG2D é um receptor de ativação importante expresso em NK, NKT, γδ T, e células T CD8+4 que permitem que tais células imunes citotóxicas reconheçam e lise NKG2D ligand (NKG2DL) expressem células-alvo. Células saudáveis geralmente não expressam NKG2DL. Em vez disso, a expressão NKG2DL é regulada em células malignas ou infectadas por vírus para torná-las favoráveis à liberação imunológica5.
A família humana NKG2DL compreende oito moléculas conhecidas entre as quais as duas moléculas relacionadas à cadeia MHC I A e B (MICA e MICB6) e as proteínas de ligação citomegalovírus UL16 1-6 (ULBP1-67). A expressão de NKG2DL é regulada nos níveis transcricional, pós-transcricional, bem como nos níveis pós-translacional8. Como tal, enquanto a expressão NKG2DL é comumente não detectável na superfície de células saudáveis, nKG2DL mRNA9 e expressão de proteína intracelular foram relatados em tecidos saudáveis. A relevância funcional de tal expressão e os mecanismos subjacentes a tais padrões de expressão discretos permanecem a ser definidos10.
A regulação mecanicista da expressão NKG2DL nas células cancerosas é uma área fascinante de investigação. Vias conhecidas por estarem envolvidas tanto no estresse celular, por exemplo, na via de estresse de choque térmico9, ou em vias associadas a danos no DNA, como a ataxia telangiectasia mutada (ATM) e a via Rad3 relacionada (ATR)11,bem como infecções virais ou bacterianas foram diretamente ligadas à indução da expressão NKG2DL12. No entanto, mesmo que a expressão superficial do NKG2DL tenha sido efetivamente induzida, essa expressão pode ser perdida novamente através do derramamento mediado proteolítico, um mecanismo associado à fuga imunológica e ao prognóstico clínico ruim em alguns cânceres13.
A ausência de nKG2DL de superfície celular também pode desempenhar papéis importantes em pacientes com LMA. Aqui, o tratamento com quimioterapia intensiva muitas vezes induz a remissão, mas a recaída ocorre frequentemente a partir de células-tronco leucmicas (LSC), que sobrevivem seletivamente às quimioterapias e evitam a resposta imune. Como mostramos recentemente, os LSCs, por exemplo, escapam da lise celular NK suprimindo a expressão de superfície NKG2DL14.
Inversamente, a ausência de expressão NKG2DL superficial pode ser usada como um método para identificar e isolar viávelmente subpopulações putativas semelhantes a troncos de células de subpopulações leucêmicas de contrapartida em massa. Aqui, apresentamos duas abordagens citométricas de fluxo que podem ser usadas para detectar a expressão da superfície NKG2DL e, assim, identificar células-tronco nkg2DL negativas na leucemia e talvez também em outros cânceres: Um método para reconhecimento da superfície pan-ligante e um método envolvendo coloração com anticorpos uni ou agrupados reconhecendo proteínas NKG2DL conhecidas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

Dentro do mesmo paciente, a ausência de ligantes NKG2D (NKG2DL) expressão superficial foi demonstrada para distinguir subpopulações leucêmicas com propriedades de células-tronco (chamadas células-tronco leucêmicas, LSCs) de células leucêmicas de contrapartida mais diferenciadas que não possuem potencial de iniciação da doença, embora carreguem mutações genéticas específicas de leucemia semelhantes. NKG2DL são bioquimicamente altamente diversos mhc classe I-like auto-moléculas. Células saudáveis em condições homeostáticas geralmente não expressam NKG2DL na superfície celular. Em vez disso, a expressão desses ligantes é induzida após a exposição ao estresse celular (por exemplo, transformação oncogênica ou estímulos infecciosos) para desencadear a eliminação de células danificadas através de lise através de células imunes expressas por receptores NKG2D, como células assassinas naturais (NK). Curiosamente, a expressão da superfície NKG2DL é seletivamente suprimida em subpopulações LSC, permitindo que essas células evitem a vigilância imunológica mediada por NKG2D. Aqui, apresentamos uma análise lado a lado de dois métodos diferentes de citometria de fluxo que permitem a investigação da expressão da superfície NKG2DL em células cancerosas, ou seja, um método que envolve reconhecimento pan-ligante e um método envolvendo coloração com múltiplos anticorpos contra ligantes únicos. Estes métodos podem ser usados para separar subpopulações celulares negativas nkg2DL viáveis com propriedades de células-tronco de câncer putativos de NKG2DL positivo não-LSC.

Ambos os protocolos aqui apresentados permitem o enriquecimento da LSC AML por meio de análises citométricas de fluxo utilizando CD34, um marcador conhecido de LSC17, em combinação com a expressão de superfície NKG2DL, utilizando reconhecimento pan-ligante ou colorindo com anticorpos agrupados contra ligantes individuais. Na Figura 1,mostramos que as amostras de LMA analisadas são positivas para CD34 e NKG2DL, mas também existem subpopulações negativas, o qu...

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Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Apresentamos dois protocolos de coloração diferentes para detecção de ligantes NKG2D (NKG2DL) em amostras de leucemia mielóide aguda primária humana (LMA). A primeira abordagem é baseada em uma proteína de fusão, capaz de reconhecer todos os ligantes conhecidos e potencialmente ainda desconhecidos, enquanto o segundo protocolo conta com a adição de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.

Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Este protocolo mostra duas maneiras distintas de detectar NKG2DLs na superfície das células AML. A técnica fornece um método de coloração rápido e fácil de usar para detectar todos os NKG2DLs conhecidos e possivelmente desconhecidos. Este método permite a separação de células-tronco leucêmicas de células AML a granel, o que torna possível caracterizar ainda mais essas células.Comece descongelando a biotina e os tubos de proteína de fusão NKG2D à temperatura ambiente. Gire rapidamente o pó NKG2D FC, depois adicione 500 microliters de PBS para reconstituir o pó e misture completamente usando uma micropipette P-1000. Adicione 100 microliters da proteína de fusão NKG2DL a um tubo de biotina para obter uma concentração final de 10 microgramas por mililitro, e misture a solução completamente com uma micropipette P-100.Para descongelar as células AML, remova o criovial contendo LMA primária do armazenamento de nitrogênio líquido e coloque-a imediatamente em um banho de água de 37 graus Celsius. Mova suavemente o tubo para frente e para trás na água, permitindo que o conteúdo do frasco descongele até que haja apenas um pequeno cristal de gelo. Transfira imediatamente as células descongeladas para o tubo médio contendo e enxágue o frasco usando um mililitro de meio.Centrifugar as células a 300 vezes G por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota. Lave as células com cinco mililitros de meio RPMI contendo 10% DE FCS e repita a centrifugação. Resuspengem a pelota celular com tampão de coloração a uma concentração final de 0,5 vezes 10 para a sétima célula por mililitro.Em seguida, transfira 100 microliters da suspensão celular para uma cultura celular 96 bem placa de fundo U e centrifugar a placa a 300 vezes G por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota. Prepare uma mistura mestre de proteína de fusão NKG2D biotinilada para que as células sejam resuspengiadas em um volume final de 50 microliters por poço com uma concentração final de NKG2D de 10 microgramas por mililitro por poço.Adicione a mistura mestre preparada e resuspenja as pelotas celulares com uma pipeta de 200 microliter. Incubar e centrifugar a placa como descrito no manuscrito do texto. Prepare uma mistura mestra usando streptavidin PE para que as células sejam resuspendidas em um volume final de 50 microliters.Adicione a mistura mestra às células e resuspenja as pelotas com uma pipeta multicanal de 300 microliter. Depois de centrifugar a placa e descartar o supernascer, use uma micropipette multicanal de 300 microlitrais para resuspencar as pelotas celulares em 200 microliters de tampão de coloração mais 7-AAD. Em seguida, analise as células usando um dispositivo de citometria de fluxo.As amostras de LMA analisadas são positivas para CD34 e NKG2DL, mas também existem subpopulações negativas, com quatro populações diferentes no total. A estratégia típica de gating começa com a seleção da população principal de células através de seu FSC e SSC. Doublets e células mortas são excluídos na análise a jusante.Os portões são ajustados usando controles FMO para garantir a identificação adequada das células positivas. As intensidades de fluorescência das células positivas para CD34 versus NKG2DL são destacadas aqui. As células AML positivas para CD34 mostram uma expressão superficial mais baixa de NKG2DL, indicando que a expressão NKG2DL está associada à falta de caule.Três amostras primárias de LMA demonstraram eventos 19,8, 49,8 e 89,4% positivos para a coloração da proteína de fusão contra 20,4, 50,4 e 90,6% para a coloração de anticorpos anti-NKG2DL agrupadas. Por outro lado, a coloração de ligas simples mostrou uma gama de eventos positivos de até 92%, com os percentuais variando de acordo com o ligante. Ao tentar este método, é muito importante ser rápido ao descongelar as células LMA primárias, pois elas são frágeis e podem morrer facilmente durante esta etapa.Após a realização deste protocolo, uma espécie de célula baseada no sinal NKG2DL pode ser realizada para investigar melhor as populações.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Pesquisa do câncer

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Fluxo Cytometric deteção da recém-formada mama câncer células-tronco células após a reversão de apoptose

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Análise por citometria de fluxo de biomarcadores apoptóticos em células de câncer cervical SiHa tratadas com Actinomicina D

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...