Name: two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (179239), Kanserle Mücadele Vakfı (Zuerich), Wilhelm Sander Vakfı'ndan CL'ye (2019.042.1) ve Novartis Tıbbi-Biyolojik Araştırma Vakfı'ndan C.L.'ye verilen hibelerle desteklendi. Ayrıca, bu proje 765104 Numaralı Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır. Basel'deki Flow Cytometry Tesisi'ne destek için teşekkür ederiz.

Basel ve Tuebingen Üniversite Hastaneleri Etik İnceleme Kurulu'nun onayı sonrasında hasta örnekleri alındı.
1. NKG2D füzyon proteininin biyotinilasyonu
NOT: Bu adım, üreticinin talimatına göre bir biyotinilasyon kiti (bkz. Malzeme Tablosu)ile gerçekleştirilir. Protokolün bu adımı lekelenmeden en az 24 saat önce yapılmalıdır. Biyotinillenmiş NKG2D füzyon proteini -20 °C'de saklanmalıdır.
<ol><li>Hem biotin hem de NKG2D fü...

<ol>
	<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+cytotoxicity:+how+do+they+pull+the+trigger.">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li><li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+biology:+an+update+and+future+directions.">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li><li>Wensveen, F. M., Jelen&#269;i&#263;, V., Poli&#263;, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D:+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness.">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).</li><li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands:+"One+for+All,+All+for+One".">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).</li><li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuity+and+the+single+receptor:+NKG2D.">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li><li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer.">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li><li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D.">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+signaling+by+inhibitory+receptors:+the+NK+cell+paradigm.">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li><li>H&#252;e, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+role+for+NKG2D/MICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease.">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li><li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells.">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium.">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li><li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells.">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion.">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li><li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice.">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li><li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34(-)+fraction.">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li><li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells:+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia.">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li></ol>

Burada, insan birincil AML hücrelerinde NKG2DL yüzey ekspresyonünü tespit edebilecek iki akış sitometrik yöntemi sunuyoruz. Her iki algılama yönteminin de diğer antikor lekeleri ile birlikte kullanılabileceğini gösteriyoruz (örneğin CD34 ekspresyonun algılanmasını). Benzer boyamalar diğer birincil hücre tiplerinde ve hücre hatlarında da yapılabilir.
Son zamanlarda AML hasta patlamalarının yüzeyinde NKG2DL'nin bulunmamasının LSC14'izenginleşt...

NK hücreleri, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kötü huylu hücreleri veya stresli sağlıklı hücreleri (örneğin, viral bir enfeksiyonla) önceden antijen stimülasyonu olmadan tanıyabilen ve ortadan kaldırabilen önemli etkileridir1. Bu işlem, doğal sitotoksisite reseptörleri (NCR), NKG2D ve CD16 gibi aktif reseptörler ve büyük ölçüde öldürücü immünoglobulin benzeri reseptörler (KIR)2ile temsil edilen inhibitör reseptörleri ile sıkı bir şekilde düzenlenir. KIR'lerin somatik hücreler üzerinde insan lökosit antijen (HLA) sınıfı I moleküllerine bağlanması, kendini tanımayı sağlar ve NK hücre toleransını iletir. Öte yandan, kendini tanımanın olmaması ve reseptörlerin hedef hücrelerdeki ligandlarına aktive etmenin artan bağlanması, NK hücre aracılı sitotoksikliğe yol açan sitotoksik granüllerin salınımını tetikler1. Son olarak, NK hücreleri, aktive edici reseptör CD16'yı Ig (FcR)2'ninFc kısmını ifade eden hedeflere bağlayarak antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik (ADCC) uygulayabilir. Doğrudan sitotoksikliğin yanı sıra, NK hücreleri de doğuştan gelenleri adaptif bağışıklık sistemi ile köprüleyen sitokin salınımını tetikleyebilir3.
NKG2D, NK, NKT, φδ T ve naif CD8+ T hücreleri4'te ifade edilen ve bu tür sitotoksik bağışıklık hücrelerinin hedef hücreleri ifade eden NKG2D ligand 'ı (NKG2DL) tanımasını ve 2.zıdamasını sağlayan önemli bir aktive edici reseptördür. Sağlıklı hücreler genellikle NKG2DL'i ifade etmez. Bunun yerine, NKG2DL ekspresyözü kötü huylu veya virüs bulaşmış hücrelerde, bunları bağışıklık açıklığı5'euygun hale getirmek için yükseltilir.
İnsan NKG2DL ailesi, aralarında MHC I zincirine bağlı iki molekül A ve B (MICA ve MICB6)ve sitomegalovirüs UL16 bağlayıcı proteinlerin 1–6 (ULBP1-67)bulunduğu bilinen sekiz molekülden oluşur. NKG2DL'nin ifadesi transkripsiyon, transkripsiyon sonrası ve çeviri sonrası düzeyler üzerinde düzenlenir8. Bu nedenle sağlıklı dokularda NKG2DL ekspresyözü sağlıklı hücrelerin yüzeyinde yaygın olarak saptanamazken, NKG2DL mRNA9 ve hücre içi protein ekspresyözü bildirilmiştir. Bu tür ifadenin işlevsel ilgisi ve bu tür gizli ifade desenlerinin altında kalan mekanizmalar tanımlanmaya devam eder10.
Kanser hücrelerinde NKG2DL ekspresyonunun mekanistik düzenlemesi büyüleyici bir araştırma alanıdır. Hücresel streste yer aldığı bilinen yollar, örneğin ısı şoku stres yolu9veya ATAKSI TELANGIEKTEKTAZI mutasyona uğramış (ATM) ve Rad3 ile ilgili (ATR) yol11gibi DNA hasarı ile ilişkili yollar ve viral veya bakteriyel enfeksiyonlar doğrudan NKG2DL ekspresyonunun indüksiyonu ile bağlantılıdır12. Bununla birlikte, NKG2DL'nin yüzey ekspresyonu etkili bir şekilde indüklenmiş olsa bile, bu ifade, bazı kanserlerde bağışıklık kaçışı ve zayıf klinik prognoz ile ilişkili bir mekanizma olan proteolitik aracılı dökülme yoluyla tekrar kaybolabilir13.
Hücre yüzeyi NKG2DL'nin yokluğu da AML'li hastalarda önemli roller oynayabilir. Burada, yoğun kemoterapi ile tedavi genellikle remisyona neden olur, ancak nüks genellikle kemoterapilerden seçici olarak kurtulan ve bağışıklık tepkisinden kaçan lösemik kök hücrelerden (LSC) ortaya çıkar. Son zamanlarda gösterdiğimiz gibi, LSC'ler, örneğin, NKG2DL yüzey ifadesini bastırarak NK hücre lizizinden kaçar14.
Tersine, yüzey NKG2DL ekspresyonunun yokluğu, hücrelerin putatif kök benzeri alt nüfuslarını toplu muadil lösemik alt nüfuslardan tanımlamak ve canlı bir şekilde izole etmek için bir yöntem olarak kullanılabilir. Burada, NKG2DL yüzey ekspresyonünü tespit etmek ve böylece lösemide ve belki de diğer kanserlerde NKG2DL negatif kök hücrelerini tanımlamak için kullanılabilecek iki akış sitometrik yaklaşımı sunuyoruz: Pan-ligand yüzey tanıma için bir yöntem ve bilinen NKG2DL proteinlerini tanıyan tek veya havuzlu antikorlarla boyama içeren bir yöntem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate U bottom</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833925500</td>
			<td>96 Well plate for our Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human cd34</td>
			<td>BD</td>
			<td>555824</td>
			<td>Antibody detecting CD34 
			RRID: AB_398614</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1391,0050</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>2-01F10-I</td>
			<td>Component of the supplemented RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.2</td>
			<td>BD</td>
			<td>/</td>
			<td>Software enabling data analysis for flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21222</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB 
			RRID: AB_1037853</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1299-NK-050</td>
			<td>Fusion Protein detecting all NKG2DLs 
			RRID:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-1 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1380</td>
			<td>Antibody detecting ULBP1 
			RRID: AB_354765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1298</td>
			<td>Antibody detecting ULBP2/5/6 
			RRID: AB_354725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ULBP-3 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1517</td>
			<td>Antibody detecting ULBP3 
			RRID: AB_354835</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICA Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-35346</td>
			<td>Antibody detecting MICA 
			RRID: AB_2552656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICB Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PA5-66698</td>
			<td>Antibody detecting MICB 
			RRID: AB_2663413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-093-385</td>
			<td>Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Component of the staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs 
			RRID: AB_2576217</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td>
			<td>Spherotech Inc.</td>
			<td>RCP-30-20A</td>
			<td>Beads used for flow cytometry device maintainance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RayBright Universal Compensation Beads</td>
			<td>Raybiotech</td>
			<td>137-00013-100</td>
			<td>Beads used to create the compensation matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S866</td>
			<td>Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two flow cytometric approaches of nkg2d ligand surface detection to distinguish stem cells from bulk subpopulations in acute myeloid leukemia

Aynı hastada, NKG2D ligandlarının (NKG2DL) yüzey ekspresyonunun yokluğunun, benzer lösemi spesifik genetik mutasyonlar taşımalarına rağmen hastalık başlatma potansiyeli olmayan daha farklılaştırılmış muadil lösemi hücrelerinden kök hücre özelliklerine (lökemik kök hücreler, LSC'ler olarak adlandırılır) sahip lösemik subpopulasyonları ayırt ettiği gösterilmiştir. NKG2DL biyokimyasal olarak çok çeşitli MHC sınıfı I benzeri öz moleküllerdir. Homeostatik koşullardaki sağlıklı hücreler genellikle hücre yüzeyinde NKG2DL'i ifade etmez. Bunun yerine, bu ligandların ekspresyasyonu, doğal öldürücü (NK) hücreler gibi NKG2D reseptör ifade eden bağışıklık hücreleri aracılığıyla lizis yoluyla hasarlı hücrelerin ortadan kaldırılmasını tetiklemek için hücresel strese (örneğin onkojenik dönüşüm veya enfeksiyöz uyaranlar) maruz kalma üzerine indüklenmiştir. İlginçtir ki, NKG2DL yüzey ekspresyözü LSC alt nüfuslarında seçici olarak bastırılır ve bu hücrelerin NKG2D aracılı bağışıklık gözetiminden kaçınmasına izin verir. Burada, kanser hücreleri üzerinde NKG2DL yüzey ekspresyonunun araştırılmasına izin veren iki farklı akış sitometri yönteminin yan yana analizini sunuyoruz, yani pan-ligand tanımayı içeren bir yöntem ve tek ligandlara karşı birden fazla antikor ile boyama içeren bir yöntem. Bu yöntemler, putatif kanser kök hücre özelliklerine sahip canlı NKG2DL negatif hücresel alt nüfusları NKG2DL pozitif LSC olmayanlardan ayırmak için kullanılabilir.

Burada sunulan protokollerin her ikisi de AML LSC'nin, LSC17'ninbilinen bir belirteci olan CD34 kullanılarak akış sitometrik analizleri ile zenginleştirilmesine izin verir, NKG2DL yüzey ekspresyonu ile birlikte pan-ligand tanıma veya bireysel ligandlara karşı havuzalanmış antikorlarla boyama. Şekil 1'de,analiz edilen AML örneklerinin CD34 ve NKG2DL için pozitif olduğunu, ancak toplamda dört farklı popülasyonun varlığıyla gösterilen negatif alt pop...

Watch this Scientific Journal Video about Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.com

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

İnsan primer akut miyeloid lösemi (AML) örneklerinde NKG2D ligand (NKG2DL) tespiti için iki farklı boyama protokolü sunuyoruz. İlk yaklaşım, bilinen ve potansiyel olarak henüz bilinmeyen tüm ligandları tanıyabilen bir füzyon proteinine dayanırken, ikinci protokol birden fazla anti-NKG2DL antikorunun eklenmesine dayanır.

Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Bu protokol, AML hücrelerinin yüzeyindeki NKG2DL'leri algılamanın iki farklı yolunu gösterir. Teknik, bilinen ve muhtemelen bilinmeyen tüm NKG2DL'leri tespit etmek için hızlı, kullanıcı dostu bir boyama yöntemi sağlar. Bu yöntem, lösemik kök hücrelerin dökme AML hücrelerinden ayrılmasına izin verir, bu da bu hücrelerin daha fazla karakterize edilerek karakterize edilemeyi mümkün kılar.Biotin ve NKG2D füzyon protein tüplerini oda sıcaklığında eriterek başlayın. NKG2D FC tozunun altını hızla aşağı çevirin, ardından tozu yeniden inşa etmek ve bir P-1000 mikropipette kullanarak iyice karıştırmak için 500 mikrolitre PBS ekleyin. Mililitre başına 10 mikrogramlık son bir konsantrasyon elde etmek için bir biotin tüpüne 100 mikrolitre NKG2DL füzyon proteini ekleyin ve çözeltiyi bir P-100 mikropipette ile iyice karıştırın.AML hücrelerini eritmek için, birincil AML içeren cryovial'ı sıvı azot deposundan çıkarın ve hemen 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Tüpü suda hafifçe ileri geri hareket ettirerek şişenin içeriğinin sadece küçük bir buz kristali kalana kadar çözülmesini sağlar. Çözülen hücreleri hemen tüp içeren ortama aktarın ve bir mililitre orta kullanarak şişeyi durulayın.Hücreleri 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin ve peletı bozmadan süpernatantı atın. Hücreleri %10 FCS içeren beş mililitre RPMI ortamıyla yıkayın ve santrifüjü tekrarlayın. Hücre peletini boyama tamponu ile mililitre başına yedinci hücrelere 0,5 çarpı 10 son konsantrasyona yeniden biriktirin.Daha sonra hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini bir hücre kültürüne aktarın 96 kuyu U-alt plaka ve plakayı 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın. Biyotinilasyonlu NKG2D füzyon proteininin ana karışımını hazırlayın, böylece hücreler kuyu başına 50 mikrolitrelik son bir hacimde, kuyu başına mililitre başına 10 mikrogramlık son bir NKG2D konsantrasyonu ile yeniden kullanılır.Hazırlanan ana karışımı ekleyin ve hücre peletlerini 200 mikroliter pipetle yeniden ıslatın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi plakayı kuluçkaya yatırın ve santrifüj edin. Streptavidin PE kullanarak bir ana karışım hazırlayın, böylece hücreler 50 mikrolitrelik son bir hacimde yeniden dirilir.Ana karışımı hücrelere ekleyin ve peletleri 300 mikroliter çok kanallı pipetle yeniden biriktirin. Plakayı santrifüj ettikten ve süpernatantı attıktan sonra, hücre peletlerini 200 mikrolitrelik boyama tamponu artı 7-AAD'de yeniden kullanmak için 300 mikrolitre çok kanallı bir mikropipette kullanın. Ardından bir akış sitomemetri cihazı kullanarak hücreleri analiz edin.Analiz edilen AML örnekleri CD34 ve NKG2DL için pozitiftir, ancak toplamda dört farklı popülasyonla negatif alt popülasyonlar da mevcuttur. Tipik gating stratejisi, FSC ve SSC aracılığıyla hücrelerin ana popülasyonunun seçilmesiyle başlar. Aşağı akış analizinde çiftler ve ölü hücreler hariç tutulur.Kapılar, pozitif hücrelerin doğru tanımlanmasını sağlamak için FDO kontrolleri kullanılarak ayarlanır. CD34 ve NKG2DL için pozitif hücrelerin floresan yoğunlukları burada vurgulanmıştır. CD34 için pozitif olan AML hücreleri, NKG2DL ekspresyonunun sap eksikliği ile ilişkili olduğunu gösteren NKG2DL'nin daha düşük bir yüzey ifadesini gösterir.Üç primer AML örneği füzyon proteini boyamada 19.8, 49.8 ve %89.4 pozitif olay gösterirken, havuza alınan anti-NKG2DL antikor boyamada %20.4, 50.4 ve %90.6 pozitif olay gösterdi. Öte yandan, tek ligand boyama, ligand'a göre değişen yüzdelerle% 92'ye kadar bir dizi olumlu olay gösterdi. Bu yöntemi denerken, birincil AML hücrelerini çözerken hızlı olmak çok önemlidir, çünkü kırılgandırlar ve bu adım sırasında kolayca ölebilirler.Bu protokol yapıldıktan sonra, popülasyonları daha fazla araştırmak için NKG2DL sinyaline dayalı bir hücre sıralaması yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Aktinomisin D ile Tedavi Edilen SiHa Serviks Kanseri Hücrelerinde Apoptotik Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Farelerde akut miyeloid lösemi üretmek için intra-peritoneal transplantasyon

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...