Dit protocol beschrijft een coatingmethode om endotheelcelgroei te beperken tot een specifiek gebied van een 6-put plaat voor pure stresstoepassing met behulp van het orbitale shakermodel. Een veel voorkomende manier om effecten van stroming op endotheel te bestuderen, is door endotheelcellen in multi-well kweekplaten op een orbitale shaker te gekweekt. De orbitale shaker induceert een golf die rond de put draait.
Cellen in het midden van de put ervaren het soort stromen waarvan wordt gedacht dat ze leiden tot atherosclerose. Cellen dichter bij de rand ervaren een stroom waarvan wordt gedacht dat ze beschermend is. Eigenschappen van de cellen in elke regio worden verondersteld af te hangen van de pure stress die ze ervaren.
Er is echter een potentiële verdieping in deze logica. Endotheelcellen geven bemiddelaars op een stroomafhankelijke manier vrij. Deze bemiddelaars zullen een uniforme concentratie bereiken in het wervelende medium en zullen daarom cellen aantasten in andere regio's dan die waar ze zijn vrijgegeven.
Dat kan de ware effecten van afschuiven op het celgedrag beschadigen of verbergen. Het effect is niet beperkt tot het wervelputsysteem. Het kan zelfs voorkomen in eenvoudige modellen, zoals de parallelle plaatstroomkamer.
Het kan worden vermeden door cellen in slechts één deel van het systeem te laten groeien. Hier beschrijven we methoden om celadhesie alleen in het midden of alleen aan de rand van de wervelput toe te staan. Fabricage van roestvrijstalen module.
Fabriceer de roestvrijstalen module van een roestvrij staal van klasse 316 volgens een meegeleverde technische tekening. 3D-printen op PMM's. Bereid een 3D CAD-model van PDMs-mal voor met SOLIDWORKS volgens de meegeleverde technische tekening.
Exporteer het CAD-model naar een STL-bestand en importeer het STL-bestand naar Cura 2.6.2. Snijd het model in lagen met een afdruksnelheid van 50 millimeter per seconde en een invuldichtheid van 60% Exporteer het bestand als een GCode. Geüpload naar een Ultimaker 3D-printer om te printen.
Gebruik polymelkzuur als drukmateriaal. Gieten van PDMS ring. Meng de PDMS-basis en het uithardingsmiddel goed met de verhouding van 90,9% basis en 9,1%-uithardingsmiddel.
Giet de goed gemengde oplossing in de 3D-geprinte mal. Verwijder bellen in een vacuüm ontgassingskamer. Hard het een uur uit in een oven van 80 graden.
Laat de PDMS-ring afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS-ring voorzichtig uit de mal. Bereiding van 1%Pluronic F-127.
Weeg vijf gram Pluronic F-127 af. Giet het in een glazen fles. Voeg vervolgens 100 miljoen Milli-Q water toe aan de glazen fles.
Dit geeft een 5%Pluronic F-127 oplossing. Zorg ervoor dat al het Pluronic F-127 poeder in het water is ondergedompeld. Sluit de dop en autoclaaf deze met behulp van een programma voor de sterilisatiecyclus van de vloeistof.
Laat de oplossing voor gebruik afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 10 mil 5%Pluronic F-127 oplossing toe aan 40 mil autoclaaf Milli-Q water om 1%Pluronic F-127 oplossing te maken. Voer de verdunning uit in een afzuigkap van een bioveiligheidskast.
Bewaar zowel 1% als 5% Pluronic F-127 bij kamertemperatuur. Coating van 6-put plaat. Autoclaaf roestvrijstalen module, PDMS-ring en pincet voor gebruik.
Voer alle daaropvolgende procedures uit in een BSC-kap en neem aseptische technieken in acht om steriliteit te garanderen. Plaats de PDMS-ring in een 6-put met een pincet. Gebruik de externe rand van de PDMS-ring om de PDMS-ring concentrisch in de put uit te lijnen.
Let op, alleen niet-weefselkweekbehandelde putplaten mogen worden gebruikt. Plaats de roestvrijstalen module met een pincet op de PDMS-ring. Steek de uiteinden van de interne borgringtang in de greepgrepen van de borgring.
Knijp in de houder om de diameter van de borgring te verkleinen. Plaats het in de 6-put, druk het stevig op de roestvrijstalen module en laat de tang los om de PDMS-ring in de put te zetten. Voeg een mil van vijf microgram per microliter fibronectine toe aan het midden of de rand van de put, afhankelijk van de interesseregio, door het openen van PDMS-ring en roestvrijstalen module.
Wervel de plaat om ervoor te zorgen dat de fibronectine-oplossing alle interessegebieden bestrijkt. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden in een bevochtigde incubator onder 95% lucht en 5% CO2. Verwijder de fibronectineoplossing uit de put.
En nu twee keer wassen met PBS. Als u klaar bent, verwijdert u de PBS volledig uit de put. Verwijder de borgring, roestvrijstalen module en PDMS-ring uit de put.
Voeg 1,5 mil 1%Pluronic F-127 toe aan de put en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur om het ongecoate oppervlak te passiveren. Haal de Pluronic F-127 oplossing uit de put en was driemaal met PBS. Eenmaal gewassen, gebruik de gecoate put onmiddellijk of bewaar op vier graden gedurende maximaal twee weken met de laag PBS in de gecoate put.
Zaaien van endotheelcellen. Tel cellen met behulp van een hemocytometer en zaad 180.000 cellen in een gecoate 6-put plaat in 1,5 mil pre-warm celkweekmedium. Schud de putplaat zijdelings om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig in de put verdelen.
Laat het 's nachts in een 37 graden bevochtigde incubator onder 95% lucht en 5% CO2. Shear stress applicatie met behulp van een orbitale shaker. Cellen moeten na drie dagen groei samenvloeien.
Vervang het medium door 1,9 mil voorgeïnd waarschuw celkweekmedium om een hoogte van twee millimeter te bereiken. Plaats een putplaat op het platform van een orbitale shaker in een bevochtigde incubator en wervel deze drie dagen bij 150 RPM. Optioneel kunnen na twee dagen afschuiven cytokinen worden toegevoegd aan het celkweekmedium om het samenspel tussen cytokinen en pure stress te onderzoeken.
Knip na de behandeling de cellen nog een dag af. In deze studie werd TNF-alpha gebruikt om de cellen te activeren. Voer de analyse uit na drie dagen van afschuifspanning.
Microscoopbeelden tonen aan dat Pluronic F-127 HUVEC-hechting aan het gebied voorkwam zonder fibronectinecoating. Er waren geen HUVECs bevestigd aan het deel van het putoppervlak dat niet was voorbehandeld met fibronectine vóór passivering van Pluronic F-127 na 24 uur, in figuur A, en 72 uur, in figuur C, van de groei. Zonder Pluronic F-127 passivering werden HUVECs zonder fibronectine aan het oppervlak bevestigd, 24 uur na het zaaien, in figuur B, en worden ze verder verspreid met 72 uur, in figuur D.De schaalbalk is gelijk aan 500 micrometer.
Nucleaire rode vlek toont de morfologie van geschoren HUVECs, A, in het midden, en B, aan de rand van een volledige put. Schaalbalk is gelijk aan honderd micrometer. A en B tonen ook celcontouren afgebakend door immunostaining van ZO-1.
Let op de uitlijning en rek van cellen aan de rand, maar niet in het midden. Het toont geen significant verschil in nucleaire vormindex, wat wijst op rondheid, tussen HUVECs die in volle put zijn gekweekt en gesegmenteerde putten werden waargenomen voor onbehandelde of met TNF-alfa behandelde HUVECs. Cellen waren meer langwerpig aan de rand van de put.
Een tendens naar een grotere rek in met TNF-alfa behandelde HUVECs was niet consistent significant op verschillende locaties. Er werd geen significant verschil waargenomen tussen volledige en gesegmenteerde putten in dichtheidsaantal A, onbehandeld, en B, TNF-alfa-behandelde HUVECs op verschillende radiale locaties. In beide gevallen waren er meer cellen per eenheidsgebied aan de rand dan in het midden van de put.
Concluderend, de methode die we hier hebben geschetst, stelt u in staat om cellen te laten groeien in slechts één gebied van de wervelende put of zelfs van elk op plastic gebaseerd celkweeksysteem. Dat betekent dat cellen in een deel van de put die één type stroom ervaren, niet worden beïnvloed door bemiddelaars die vrijkomen uit cellen in een andere regio die verschillende stromen ervaren. Niet alleen dat, we kunnen kijken naar cellen die in één regio worden gekweekt met of zonder cellen die in andere regio's worden gekweekt.
Dat maakt het mogelijk om de effecten van dergelijke oplosbare mediatoren aan te toonden. Het testen van de effecten van geconditioneerd medium op naïeve cellen maakt hetzelfde mogelijk. Door het conditiemedium te analyseren, kunnen de bemiddelaars worden geïdentificeerd.