Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 &af T32 Training Grant 5T32GM081740

Alle dyreprotokoller blev gennemgået og godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina.
1. Forberedelse af stamopløsning
<ol><li>Opløsning 1 (1 L): Til 900 ml deioniseret H2O tilsættes 100 ml 10x fosfat buffered saltvand (PBS) og 2 ml Triton X-100.</li>
	<li>Opløsning 2 (1 L): Til 900 ml deioniseret H2O tilsættes 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 og 1 ml 10 mg/mL Heparin-stamopløsning.</li>
	<li>Opløsning 3 (500 ml): Til 400 ml opløsning...

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

Vævsrydning tilbyder en løsning på begrænsningerne i den traditionelle IHC-protokol. En prøve, der er gennemsigtig minimerer spredning og absorption af lys, som giver cellulært niveau optisk adgang til intakt væv18,19. Vævsrydningsteknikker gør et væv gennemsigtigt gennem aflipidation, affarvning og afkalkning ved administration af opløsningsmidler. Når vævsprøvens brydningsindeks svarer til det brydningsindeks for det valgte billedmedium, vises pr?...

Flere væv clearing teknikker er blevet valideret til brug i hjernen: hydrogel, hydrofil, og hydrofobisk. Disse teknikker har til formål at gøre et væv gennemsigtigt gennem afføring, affarvning og afkalkning via indgift af opløsningsmidler. Når vævsprøvens brydningsindeks svarer til det valgte billedmediums brydningsindeks, kan der opnås et klart billede af prøven. Hydrogelbaserede teknikker, såsom KLARHED, sikrer biomolekyler i vævet ved at forbinde dem med akrylsbaserede hydrogeler, som forhindrer strukturelle skader og tab af proteiner1. Hydrogel-teknikker anvender imidlertid barske kemikalier end har potentiale til at beskadige mere skrøbelige væv, og tættere vævsprøver er muligvis ikke kompatible med hydrogelprotokollen. Visse hydrogel teknikker kan kræve dyrt udstyr eller føre til væv ekspansion. Hydrofile teknikker, som CUBIC, bevarer 3D-struktur gennem dannelsen af hydrogenbindinger i vævet2. Vævsudvidelse kan også forekomme i visse hydrofile protokol. De hydrofile teknikkers clearingevne matcher ofte ikke den evne, som hydrofobe teknikker har, hvilket er vigtigt for tættere og tykkere væv3.
Hydrofobe teknikker er normalt hurtige, kræver ikke specielt udstyr og producerer en prøve, der er let at håndtere og opbevare. iDISCO er en hydrofobisk teknik, der eliminerer krympning, der kan forekomme i andre hydrofobe protokol. Oprindeligt blev iDISCO-vævsclearingteknikken beskrevet af Renier et al.4 for embryoner og tætte, voksne organer hos mus. Denne teknik fjerner vand fra vævet i det indledende dehydreringstrin og reducerer derved lysspredningen. Væv er gennemtrængelig under forbehandling at tillade dyb antistof penetration. Alexa Fluor farvestoffer i det langt røde spektrum bruges til immunolabeling for at undgå autofluorescens af vævet ved lavere bølgelængder5. Væv, der har gennemgået hydrofobe clearing protokoller er i stand til at håndteres nemt og kan afbildes flere gange på grund af levetiden af Alexa Fluor farvestoffer. Hvis de opbevares korrekt, kan væv give billeder i måneder til et år efter den første behandling.
I denne protokol blev tyrosinhydrafylase (TH) antistof, Iba1 antistof og Koleratoksin subunit B (CTB) anvendt på både mandlig og kvindelig kontrol og HIV-1 transgene (Tg) rottehjerner. HIV-1 Tg-rotten besidder syv af de ni gener, der udgør HIV-1 viralt genom, hvilket fører til en ikke-infektiøs model for langvarig HIV-1 proteineksponering6,7,8. Dopaminergiske ændringer er tidligere blevet påvist i HIV-1 Tg-rotten, og HIV-1 i sig selv er en inflammatorisk sygdom, så antistofvalget var relevant for det eksperimentelle design9,10,11,12. CTB er en sporstof, der tillægger neuroner via ganglioside bindende og kan bruges til at spore afferente fremskrivninger i hjernen. CTB har tidligere været brugt til at studere fremskrivninger fra kernen accumbens til substantia nigra området, to områder af hjernen stærkt involveret med dopaminergiske veje13,14,15.
I denne protokol vil TH fungere som en markør for dopaminproduktion, og Iba1 vil markere aktiveret mikroglia. Det anvendte TH-antistof mærker selektivt et enkelt bånd på ca. 62 kDa, der svarer til tyrosinhydroxylase. Iba1-antistoffet svarer til Iba1-carboxyterminalsekvensen. Begge antistoffer blev opdrættet i kanin og var polyklonale. CTB vil blive anvendt til retrograd sporing af neuroner fra kernen accumbens område til substantia nigra området. Den nuværende protokol indeholder også en retningslinje for justering af den oprindelige iDISCO-protokol på to forskellige måder: 1) samlet reduktion af baggrundsfarvningen ved at ændre serumreagenserne i blokeringstrinnene og 2) skalering af inkubationstiden for at være egnet til større vævsprøver. Samlet set giver denne protokol fortsat bevis for, at hydrofobe clearingteknikker er mulige i rotters hjernevæv, ikke har nogen mærkbar skadelig interaktion med HIV-1-virusproteiner og er kompatible med TH-antistof, Iba1-antistof og CTB.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41121-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 primary antibody</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-sil epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1l-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td>mini pump variable flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

Hydrofobe vævsclearingmetoder er let justerbare, hurtige og billige procedurer, der giver mulighed for undersøgelse af et molekyle af interesse for uændrede vævsprøver. Traditionelle immunolabelingsprocedurer kræver, at prøven skæres i tynde sektioner, hvilket begrænser evnen til at mærke og undersøge intakte strukturer. Men hvis hjernevævet kan forblive intakt under behandlingen, kan strukturer og kredsløb forblive intakte til analysen. Tidligere etablerede clearingmetoder tager betydelig tid at rydde vævet fuldstændigt, og de hårde kemikalier kan ofte skade følsomme antistoffer. IDISCO-metoden rydder hurtigt og fuldstændigt væv, er kompatibel med mange antistoffer og kræver intet specielt laboratorieudstyr. Denne teknik blev oprindeligt valideret til brug i mus væv, men den nuværende protokol tilpasser denne metode til billedet halvkugler af kontrol og transgene rotte hjerner. Derudover foretager denne protokol også flere justeringer af den allerede eksisterende protokol for at give klarere billeder med mindre baggrundsplejning. Antistoffer for Iba-1 og tyrosinhydroxylase blev valideret i hiv-1-transgene rotter og i F344/N-kontrolrotter ved hjælp af den nuværende hydrofobe vævsclearingmetode. Hjernen er et sammenvævet netværk, hvor strukturer arbejder sammen oftere end hver for sig. Analyse af hjernen som et helt system i modsætning til en kombination af individuelle stykker er den største fordel ved hele denne hjerne clearing metode.

Fuld rydning af store dele af både F344/N og HIV-1 rottehjernevæv blev opnået ved hjælp af denne modificerede hydrofobe vævsclearingprotokol. Figur 1 viser et typisk konfokalt billede for TH i substantia nigra-regionen. Figur 1A repræsenterer tæt, positiv farvning. Tætte områder som disse kan analyseres ud ved at fokusere gennem "Z" plan for at bekræfte positiv farvning og korrekt celle morfologi. Figur 1B repræsenterer s...

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Her præsenterer vi en hydrofobisk vævsclearingmetode, der giver mulighed for visning af målmolekyler som en del af intakte hjernestrukturer. Denne teknik er nu blevet valideret for F344/N kontrol og HIV-1 transgene rotter af begge køn.

En hydrofobisk vævsclearingmetode til rottehjernevæv

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intakt Histologisk Karakterisering af Brain-implanterede Microdevices og det omgivende væv

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistokemisk analyse i Rat centralnervesystemet og det perifere lymfeknude Vævssnit

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer til Immunhistokemi på Cryosectioned Rat Brain Tissue: Eksempel farvning for Mikroglia og Neuroner

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimation af DAN Matrix til påvisning og Visualisering af Gangliosider i Rat Brain Tissue for MALDI Imaging massespektrometri

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

En rotte Model af Mild intrauterin Hypoperfusion med Microcoil stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Roman passiv Clearing metoder til hurtig fremstilling af optiske gennemsigtighed i hele CNS væv

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering af cerebrale kapillærer fra frisk menneskelige hjernevæv

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...